《與乾旱脅迫相關的細胞膜Ca2+通道的功能驗證》是依託西北大學，由黃萱擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：與乾旱脅迫相關的細胞膜Ca2+通道的功能驗證
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：黃萱
- 依託單位：西北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
鈣離子作為胞內的第二信使，對植物各種逆境信號轉導起著重要作用。植物在受到環境脅迫（如乾旱脅迫）時，細胞質中的鈣濃度會出現特異性的變化，如細胞膜上的Ca2+通道會使細胞外的Ca2+內流，導致胞質內的Ca2+濃度在短時間內急速增加。但是，由於植物Ca2+通道與其它物種已知的Ca2+通道同源性不高以及檢測方法的局限，在植物細胞膜上還沒有發現功能明確的Ca2+通道。本研究以具有水母素螢光蛋白為背景的擬南芥突變體庫為實驗材料，在乾旱脅迫的情況下，通過鈣成像系統檢測在植株水平獲得的鈣信號瞬間差異來獲得有價值的突變體，並且通過檢測T-DNA片段插入位置獲得目的基因。同時，本研究將通過進行胞內游離鈣含量測定、突變體鈣成像的功能補償實驗、突變體植株乾旱生理實驗、基因表達分析及亞細胞定位研究等方法驗證該Ca2+通道的具體功能，期望獲得能夠對乾旱脅迫特異回響的Ca2+通道。這將有利於今後開展植物抗旱研究。
結題摘要
目前，對植物細胞膜上是否存在受乾旱脅迫開啟的鈣通道研究很少，所涉及的信號通路也不清楚。我們的項目是利用以水母素螢光蛋白為背景的擬南芥T-DNA插入突變體庫為實驗材料，在以山梨醇作為乾旱脅迫劑時檢測突變體庫萌發苗中鈣激發光的強弱來確定可能的鈣通道蛋白，繼而進行蛋白功能驗證。 本項目組篩選了大約3萬個T-DNA突變體株系，所得候選突變體進行了3～4個世代的鈣成像分析來確定表型遺傳的穩定性，表型穩定的突變體又進行了脅迫特異性回響實驗，以此來證明鈣信號缺失確實是由乾旱脅迫產生的。最終確定的突變體通過TAIL-PCR及接頭酶連PCR的方法尋找T-DNA在擬南芥基因組中的插入位點來確定突變基因。通過Southern 印跡雜交我們確定該突變體為單位點插入，其鈣信號不敏感特性是由我們所檢測到的基因突引起的。最終，我們獲得了一個定位在細胞膜上的六跨膜蛋白，該蛋白的功能未知，我們將其命名為DS (drought sensor)蛋白。Northern結果證明該基因受乾旱脅迫誘導表達。 為進行DS功能驗證，我們構建了水母素螢光蛋白（AQ）為背景的DS：：35S過表達突變體及ds-1、ds-2缺失突變體。在以山梨醇水溶液為脅迫劑時，我們發現，在400mM左右山梨醇脅迫時，缺失突變體表現出對乾旱的敏感性，萌發率低，根和下胚軸變短，萌發苗易變黃且弱，而過表達突變體表現出對乾旱脅迫的耐受性。在進行鈣信號檢測實驗時，我們發現ds-1和ds-2表現出鈣信號激發受阻的現象，而當ds-1和ds-2突變體重新轉入DS基因，鈣信號激發恢復正常。這樣的突變體鈣成像功能補償實驗說明DS直接參與受乾旱脅迫誘導的鈣通道信號轉導。DS亞細胞定位實驗也證明DS是位於植物細胞膜上的蛋白質。但是，由於在利用爪蟾卵母細胞進行胞內鈣離子濃度變化的膜片鉗實驗並沒有獲得明顯的電流變化，我們推測DS蛋白雖然直接參與了受乾旱誘導的鈣通道蛋白的早期信號轉導，但並不是鈣通道本身。DS的發現為下一步研究相關通道蛋白及蛋白互作，了解植物乾旱誘導的上游信號轉導打下重要基礎。目前，整個研究結果正在進行整理。 項目發表論文9篇，其中SCI 1篇；授權發明專利2項，培養研究生2名。
