《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》是蘇州艾傑生物科技有限公司於2004年2月18日申請的專利，該專利的申請號為2004100140963，公布號為CN1641043，授權公布日為2005年7月20日，發明人是王爾中，該發明屬於醫學檢驗測定技術領域。
《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》以腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合為診斷試劑主成分，通過一系列的酶偶聯反應，將最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400－600納米波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便。與2004年2月前已有技術相比，該發明不僅便於推廣套用，而且由於所生成的染料均有較高的摩爾消光係數，因此靈敏度高、精確度好。此外，反應過程中的成分都是外加的，所以不受內外源物質的污染。
2007年，《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》獲得第五屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
基本介紹
- 中文名：腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑
- 公布號：CN1641043
- 公布日：2005年7月20日
- 申請號：2004100140963
- 申請日：2004年2月18日
- 申請人：蘇州艾傑生物科技有限公司
- 地址：江蘇省蘇州市蘇州工業園區科技園（機場路328號122B）
- 發明人：王爾中
- 分類號：C12Q1/42、C12Q1/25
- 代理機構：南京蘇科專利代理有限責任公司
- 類別：發明專利
- 代理人：何朝旭、姚姣陽
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關係的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水、腦脊液鑑別診斷、重症聯合免疫缺陷病（SCID）、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病鑑別的重要診斷標誌。
腺苷脫氨酶的活性測定方法較多，主要有放射核素法、物理方法和生化法。據申請人了解，2004年2月前國際上普遍採用紫外光法，其測定原理是：腺苷（Adenosine）+水（H2O）腺苷脫氨酶肌苷（Inosine）+氨離子（NH4），此反映過程生成的肌苷會在波長為265納米處顯現，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣套用。
檢索發現，申請號為03128092.7、申請日為2003.05.29、名稱為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其製法》的中國專利申請公開了套用酶反應產物氧化型煙醯胺輔酶配製的測定試劑。該發明所指的酶法測定試劑並不加入測定反應所需的還原型煙醯胺輔酶或其類似物，而加入其反應產物氧化型煙醯胺輔酶或其類似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統，通過在試劑內形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環還原為還原型煙醯胺輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙醯胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發明的特點在於為腺苷脫氨酶的測試提供一個內源合成腺苷脫氨酶反應所需要的底物—還原型煙醯胺輔酶—的腺苷脫氨酶試劑。其缺點為這個系統在生成反應所需要的還原型煙醯胺輔酶的同時，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑（腺苷脫氨酶偶聯谷氨酸脫氫酶反應必定將還原型煙醯胺輔酶氧化成氧化型煙醯胺輔酶）的活性。
發明內容
專利目的
《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》提出一種不需要還原型煙醯胺輔酶，並且藉助可見光分析儀即可測定腺苷脫氨酶活性的方法，同時，該發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑，從而大大方便通過測定腺苷脫氨酶活性的進行良惡性胸腹水、腦脊液鑑別診斷、重症聯合免疫缺陷病（SCID）、急、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等等各種疾病的診斷，使之可以在中、小醫院得到推廣套用。
技術方案
《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》腺苷脫氨酶活性測定方法步驟如下：
1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子；
2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖；
3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫；
4、過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水；
5、將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測400—600納米（根據還原型色原體組合的不同而定）處直接反映吲嗒胺色原（Indamine dye）或醌亞胺色原（Quioneimine dye）含量高低的光吸收大小，得出腺苷脫氨酶測定結果。
用於實現以上方法的腺苷脫氨酶診斷試劑主劑為：腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
以上主劑按如下比例組合，測定結果較好
腺苷1—50摩爾/升、單價磷酸鹽0.2—10摩爾/升、核苷磷酸酶500—50000單位/升、黃嘌呤氧化酶500—50000單位/升、過氧化物酶500—50000單位/升、還原型色原體組合0.1—20摩爾/升、其餘是緩衝液、穩定劑。
以上測定的溫度控制在20℃到50℃，各反應步驟的反應時間控制在2-30分鐘，各試劑以基本相同的劑量按步驟加入，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例、即樣品試劑比控制在1/10到1/250，可以獲得較好的測定結果。
以上還原型色原體組合（Chromogen）可以是0.5-20摩爾/升的3-甲基-2-苯噻唑酮腙（3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡稱MBTH）或0.5-20摩爾/升的4-氨基抗砒（4-aminoantipyrine）與0.1—20摩爾/升以下十四種成分之一組合而成：石碳酸（phenol）；N-乙基-N-（3-硫丙基）-m-噻啶胺（N-ethyl-N-（3-sulfopropyl）-m-anisidine簡稱ESPAS）；N，N-雙乙基-m-甲苯胺（N，N-Diethyl-m-toluidine）；2，4-雙氯石碳酸（2，4-Dichloriphenol）；2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸（2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid簡稱TBHB）；3，5-雙氯石碳酸磺酸（3，5-Dichlorophenolsulfonic acid）；3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸（3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid簡稱DHBS）；N-乙基-N-（2-羥基-3-硫丙基）-m-甲苯胺鈉鹽（N-ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-m-toluidine-sodium簡稱TOOS）；仨溴羥基苯甲酸（Tribromohydroxybenzoic acid）；雙甲基苯胺（Dimethylaniline簡稱DMA）；N-乙基-N-（2-羥基-3-硫丙基）-m-甲苯胺（N-Ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-m-toluidine簡稱EHSPT）；2，2′-AZINO-雙（3-乙基苯噻唑-6-磺酸）（2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）簡稱ABTS；4-羥基-3-甲氧基苯甲酸（Vanillicacid（4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid）簡稱HMB）；3-甲基-乙基-羥基苯胺（3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡稱MEHA）。
改善效果
《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》的測定方法通過腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等一系列的酶偶聯反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的吲嗒胺色原或醌亞胺色原，從而可以通過可見光分析儀器，在400—600納米波長處，測定吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量的高低，進而直接反映出腺苷脫氨酶活性的大小，為多種疾病的診斷提供方便，整個測定過程只需按步驟加入試劑即可，一氣呵成，便於操作。與2004年2月前已有技術相比，該發明不僅便於推廣套用，而且由於所生成的吲嗒胺色原或醌亞胺色原均有較高的摩爾消光係數，因此靈敏度高、精確度好。此外，反應過程中的成分都是外加的，所以不受內外源物質的污染。
權利要求
1.一種腺苷脫氨酶活性測定方法，步驟如下：
1）腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子；
2）肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖；
3）次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫；
4）過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水；
5）將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測400—600納米處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收大小，得出腺苷脫氨酶測定結果；
所述還原型色原體為0.5-20摩爾/升的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20摩爾/升以下十四種成分之一組合而成：石碳酸；N-乙基-N-（3-硫丙基）-m-噻啶胺；N，N-雙乙基-m-甲苯胺；2，4-雙氯石碳酸；2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸；3，5-雙氯石碳酸磺酸；3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸；N-乙基-N-（2-羥基-3-硫丙基）-m-甲苯胺鈉鹽；仨溴羥基苯甲酸；雙甲基苯胺；N-乙基-N-（2-羥基-3-硫丙基）-m-甲苯胺；2，2′-AZINO-雙（3-乙基苯噻唑-6-磺酸）；4-羥基-3-甲氧基苯甲酸；3-甲基-乙基-羥基苯胺。
2.根據權利要求1所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特徵在於：測定溫度控制在20℃到50℃。
3.根據權利要求2所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特徵在於：被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
4.根據權利要求2或3所述腺苷脫氨酶活性測定方法，其特徵在於：各反應步驟的反應時間控制在2-30分鐘。
5、一種腺苷脫氨酶診斷試劑，主劑為：腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。
6、根據權利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特徵在於：所述主劑的比例為：腺苷1—50摩爾/升、單價磷酸鹽0.2—10摩爾/升、核苷磷酸酶500—50000單位/升、黃嘌呤氧化酶500—50000單位/升、過氧化物酶500—50000單位/升、還原型色原體組合0.1—20摩爾/升、其餘是緩衝液、穩定劑。
7、根據權利要求6所述腺苷脫氨酶診斷試劑，其特徵在於：所述還原型色原體組合中的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或4-氨基抗砒為0.5-20摩爾/升，其它成分為0.1-20摩爾/升。
實施方式
實施例一
該實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有：緩衝液100摩爾/升、腺苷10摩爾/升、單價磷酸鹽5摩爾/升、核苷磷酸酶6000單位/升、黃嘌呤氧化酶8000單位/升、過氧化物酶20000單位/升、4-氨基抗砒2摩爾/升、石碳酸10摩爾/升。
測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在36.5—37.5℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/25，具體測定步驟為：
1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子；
2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖；
3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫；
4、過氧化氫+4-氨基抗砒+石碳酸過氧化物酶醌亞胺色原+水；
5、將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測500納米處的醌亞胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在8-12分鐘。
實施例二
該實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有：緩衝液100摩爾/升、腺苷5摩爾/升、單價磷酸鹽1摩爾/升、核苷磷酸酶800單位/升、黃嘌呤氧化酶800單位/升、過氧化物酶800單位/升、4-氨基抗砒0.6摩爾/升、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸0.2摩爾/升。
測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在29—31℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/15，具體測定步驟為：
1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子；
2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖；
3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫；
4、過氧化氫+4-氨基抗砒+2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸過氧化物酶醌亞胺色原+水；
5、將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測546納米處的醌亞胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在4-6分鐘。
實施例三
該實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有：緩衝液100摩爾/升、腺苷45摩爾/升、單價磷酸鹽8摩爾/升、核苷磷酸酶40000單位/升、黃嘌呤氧化酶42000單位/升、過氧化物酶50000單位/升、3-甲基-2-苯噻唑酮腙15摩爾/升雙甲基苯胺18摩爾/升。
測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在24—26℃，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/200，具體測定步驟為：
1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子；
2、肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖；
3、次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫；
4、過氧化氫+3-甲基-2-苯噻唑酮腙+雙甲基苯胺過氫化物酶吲嗒胺色原+水；
5、將最終反應物置於可見光分析儀下，檢測578納米處的吲嗒胺色原含量的高低，得出腺苷脫氨酶測定結果。
各反應步驟的反應時間控制在14-16分鐘。
該發明申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達到該發明的目的，鑒於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，採用《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》的測定方法完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染。
榮譽表彰
2007年，《腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑》獲得第五屆江蘇省專利項目獎優秀獎。
