腫瘤細胞線粒體DNA拷貝數異常改變的分子基礎研究

《腫瘤細胞線粒體DNA拷貝數異常改變的分子基礎研究》是依託中國人民解放軍第四軍醫大學，由邢金良擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：腫瘤細胞線粒體DNA拷貝數異常改變的分子基礎研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：邢金良
• 依託單位：中國人民解放軍第四軍醫大學

中文摘要

線粒體DNA（mtDNA）是細胞內獨立於核基因組之外的遺傳物質，在人體生理及病理過程中發揮重要功能。本項目組及其他小組的研究結果表明：在多種腫瘤細胞中，mtDNA拷貝數呈現異常升高或降低。大量研究也證實mtDNA拷貝數異常與腫瘤發生及進展密切相關。然而，導致腫瘤中mtDNA拷貝數異常改變的分子機制至今尚不十分清楚。本項目組基於以往在腫瘤和mtDNA方面的研究基礎和豐富經驗，擬以mtDNA拷貝數顯著升高的大腸癌及顯著降低的肝癌作為代表性研究對象，基於臨床標本及細胞模型，利用實時定量PCR方法檢測mtDNA拷貝數，套用第二代高通量測序技術評估mtDNA的序列變異，藉助免疫染色等形態學方法觀察線粒體類核結構及線粒體自噬的變化，並通過免疫組織化學、實時定量PCR、DNA測序等手段分析mtDNA拷貝數調控關鍵分子在基因及蛋白水平的改變，進而系統性探討腫瘤細胞中導致mtDNA拷貝數異常改變的分子基礎。

結題摘要

線粒體DNA（mtDNA）是細胞內獨立於核基因組之外的遺傳物質，在人體生理及病理過程中發揮重要功能。大量研究證實mtDNA拷貝數異常與腫瘤發生及進展密切相關。然而，導致腫瘤中mtDNA拷貝數異常改變的分子機制至今尚不十分清楚。 項目組圓滿完成項目預期目標，並取得如下研究成果：（1）建立系統規範的肝癌及大腸癌生物樣本資源庫；（2）建立系統全面的mtDNA序列檢測技術平台；（3）發明一種全新的雙barcode二代測序文庫構建方法，有效減少甚至消除基因捕獲過程中樣本間的交叉污染問題；（4） 發現基因捕獲（capture）方法富集線粒體DNA相比於基於PCR技術富集的mtDNA測序後覆蓋深度分布更加均一，解決線粒體DNA富集方法覆蓋不均一的問題；（5）完成200例肝癌組織和100例大腸癌mtDNA的全基因測序及分析；（6）完成大腸癌及肝癌細胞株的mtDNA全基因組測序；（7）完成近300例外周血淋巴細胞mtDNA拷貝數與肝癌發病及預後相關性分析；（8）完成近600例外周血淋巴細胞mtDNA拷貝數與大腸癌發病及預後相關性分析；（9）完成近300例大腸癌組織mtDNA拷貝數調控關鍵分子的篩選分析及相關性分析；（10）完成大腸癌組織mtDNA拷貝數調控關鍵分子的預後分析；（11）建立大腸癌mtDNA拷貝數調控關鍵分子POLG的細胞模型並進行mtDNA特定複製調控關鍵分子表達的調控作用分析；（11）完成近200例肝癌組織mtDNA拷貝數調控關鍵分子的篩選分析；（12）建立肝癌mtDNA拷貝數調控關鍵分子TFAM的細胞模型並進行機制研究；（13）發現並闡明CD147分子抑制mtDNA拷貝數的作用機制：①利用鋅指核酸酶技術成功構建了CD147基因敲除的肝癌細胞；②利用新一代測序技術對CD147分子敲除的肝癌細胞系轉錄組進行深度測序發現：CD147敲除後線粒體氧化呼吸鏈複合體部分基因表達顯著上調；③CD147分子可通過激活PI3K/Akt信號通路促進MDM2分子的磷酸化，進而導致mtDNA複製關鍵調控基因p53分子的降解，促使其下游mtDNA複製基因PGC1a、TFAM、SOC2的表達降低，最終下調了mtDNA在肝癌細胞中的拷貝數及線粒體發生；（14）發現Drp1蛋白可以通過調控線粒體融合分裂影響肝癌細胞mtDNA拷貝數,Drp1過表達可顯著促進線粒體融合進而促進肝癌細胞mtDNA拷貝數生成增加和肝癌轉移。