用納米金探針檢測卵巢癌線粒體DNA突變的研究

《用納米金探針檢測卵巢癌線粒體DNA突變的研究》是依託廈門大學，由孫莉萍擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：用納米金探針檢測卵巢癌線粒體DNA突變的研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：孫莉萍
• 依託單位：廈門大學

項目摘要

卵巢癌是女性生殖器中最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤的第一位，缺乏有效的早期檢測手段。線粒體DNA的高突變率以及在癌細胞中的高拷貝數使其成為腫瘤非侵入性診斷的有效分子標記。本項目的目標是建立一種檢測卵巢癌線粒體DNA突變的新方法，簡化DNA突變的檢測過程，使檢測靈敏度和準確性大大提高。項目以幾種不同來源的標本（卵巢癌組織、血液、腹腔液、卵巢癌細胞系）為研究對象，在卵巢癌突變熱點集中的16S、12SrRNA基因、Cytb基因和D-loop區域針對不同類型的線粒體DNA突變設計寡核苷酸探針，用納米金-寡核苷酸探針可以同時檢測線粒體DNA多個突變。並探索納米金粒徑大小、核酸探針序列、密度和長度、反應溫度、反應體系鹽濃度和pH值、靶DNA等因素對納米金探針檢測線粒體DNA突變效率的影響，為卵巢癌的早期診斷、治療以及預後的判斷提供一個簡單、快速的新工具，具有良好的臨床套用前景。

結題摘要

本研究用納米金比色法和石墨烯-DNA水凝膠電極巧妙地檢測了卵巢癌線粒體DNA突變，簡化了DNA突變的檢測過程。項目在卵巢癌突變熱點集中的16S、12SrRNA基因、Cytb基因和D-loop區域針對不同類型的線粒體DNA突變設計寡核苷酸探針。我們還意外發現還原石墨烯能夠大大增強聚合酶鏈式反應（PCR）的特異性，經過多輪PCR擴增（最高達到8輪）後仍然可以得到目的產物；還原石墨烯降低了PCR的退火溫度，使PCR反應低至25 ˚C時依然能夠退火，得到單一的目的產物；對PCR擴增產物進行序列測定，結果顯示石墨烯參與的PCR反應產物序列與標準序列沒有差異。Zeta電位、紫外-可見光譜及圓二色光譜分析表明石墨烯與DNA聚合酶、DNA模板間的相互作用，以及石墨烯良好的導熱性是PCR反應特異性增強的主要原因。用納米金-寡核苷酸探針可以分辨線粒體DNA的單鹼基突變，靈敏度為3.3 nM。該方法雖然簡便易行，但靈敏度還不夠高。因此我們又用氧化石墨烯-DNA水凝膠構建了一種新型電化學生物感測器，探索了溫度、反應體系鹽濃度和pH值等因素對感測器的影響。用掃描電鏡、原子力顯微鏡、X射線衍射等方法對氧化石墨烯-DNA水凝膠進行了表征。用探針DNA修飾該電極後，採用電化學阻抗譜(EIS)成功地檢測了卵巢癌線粒體DNA的單鹼基突變，最低檢測限達到1.0 × 10-20 M 。探針DNA與不同濃度（C）互補序列雜交前後的阻抗變化（ΔR）顯示ΔR與-logC間具有良好的線性關係。探針序列與單鹼基錯配序列以及非互補序列雜交前後的阻抗變化值遠低於其與互補序列雜交前後的阻抗變化值，證實該電極對DNA突變檢測具有良好的選擇性。本方法不需要對探針或待測樣品進行任何化學或螢光標記，檢測靈敏度和準確性大大提高，具有良好的臨床套用前景。