《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》是夏中寧於2006年3月23日申請的發明專利，該專利的申請號為2006100651690，公布號為CN1857711，公布日為2006年11月8日，發明人是劉全勝、夏中寧、舒軍、林學良，該專利屬於製藥領域。
《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》包括取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，採用濾紙進行過濾，收集濾出液；濾出液上羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化，調配肽圖，收集目標物，採用對分子截留為8千道爾頓的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、胺基酸分析，按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的藥品標準（編號WS1－XG－25－2000）計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，即得注射用腦蛋白水解物的原液。還可進一步按凍乾製劑處方製備成腦蛋白水解物凍乾製劑。該方法環保且收率高，成本低。
2014年11月6日，《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法
- 公布號：CN1857711
- 公布日：2006年11月8日
- 申請號：2006100651690
- 申請日：2006年3月23日
- 申請人：夏中寧
- 地址：夏中寧
- 發明人：劉全勝、夏中寧、舒軍、林學良
- 分類號：A61K38/01（2006.01）、A61K35/30（2006.01）、A61K9/19（2006.01）、A61P25/00（2006.01）
- 代理機構：北京集佳智慧財產權代理有限公司
- 類別：發明專利
- 代理人：孫長龍
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
腦蛋白水解物在中國國內又稱腦活素，早於20世紀90年代初，中國國內學者便對其工藝、質量、藥理藥效及臨床套用進行了研究，發表了大量的文章。
中國發明專利文獻CN01130523.1公開了一種“腦蛋白水解物注射液生產工藝”，其內容是：新鮮豬腦去除表面的黏膜及血漬等，加2倍體積的水勻漿，用雙層紗布過濾，濾液先用胃蛋白酶水解，用鹽酸調pH到1.5～1.6，水浴溫度40～45℃，時間為6～8小時，再用氫氧化鈉調pH到7.6～7.7，加胰酶（胰酶先溶解於0.02N的氯化鈣溶液中於4℃下活化30分鐘）水解，40～45℃水浴水解4～6小時，得到水解液，加鹽酸調pH值2.5～3.0，-20～10℃下靜置10～30小時；在室溫條件下，用雙層紗布過濾，再加入1/2體積的水，加氫氧化鈉調pH值到中性，用孔徑為0.5～1.0微米的微孔濾膜過濾澄清，取澄清液，依次用截流分子量為7萬和1萬的超濾膜超濾，得到的超濾液再用截流分子量為1000的超濾膜進行濃縮，得到的濃縮液加熱到100℃沸騰15分鐘，然後迅速冷卻到25℃以下，再依次經過0.5～1微米孔徑的微孔濾膜和截流分子量為7萬和1萬的超濾膜，得到的超濾液再經121℃蒸汽滅菌30分鐘得到的除菌溶液稱為腦蛋折水解的混合多肽、胺基酸溶液精製品；根據所需藥液量，按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的藥品標準（編號WS1-XG-25-2000）計算需要添加的胺基酸用量，與上述溶液配製成濃配液，然後稀配裝針成成品藥液，經121℃蒸汽滅菌30分鐘成無菌製劑。其缺點是：（1）料液多次經過0.5～1微米孔徑的微孔濾膜和截流分子量為7萬和1萬的超濾膜，得到的超濾液，使操作比較煩瑣，生產周期長，生產過程中容易受微生物污染。（2）使用超濾膜進行超濾濃縮回收率低：該工藝採用截流分子量為1000的超濾膜進行濃縮，因腦蛋白水解物的有效活性成分為小分子多肽，在超濾濃縮過程中會有不同程度的透過丟失，收率大大降低。
2000年，余李碧等在《胺基酸和生物資源》發表了“腦蛋白粉的製備及其酶解方法的研究”，其內容為：取鮮豬腦去膜、去血塊洗淨，按1:5（w/v）加入生理鹽水勻漿，再按1:10（w/v）加入冰凍丙酮攪拌提取2小時，靜置分層後紗布過濾，共提取4次。濾塊用乙醚按1:10（w/v）提取2次，過濾，濾塊乾燥，腦粉按1:20（w/v）加蒸餾水溶解，煮沸30分鐘，於47±0.5℃平衡，用NaOH調pH8.0，加胰酶水解30小時，用HCl調pH6.0，煮沸40分鐘，稍冷，過濾，濾液煮沸、冷卻、4℃存放過夜。布氏漏斗抽濾，收集濾液，浴溫58～69℃減壓濃縮至原體積的1/3，煮沸、冷卻、4℃存放24小時。抽濾得濾液，補加無熱源水至原體積、6％白陶土和0.6％活性炭，調pH4.4～4.6，煮沸1小時，趁熱抽濾得濾液。調pH7.0，煮沸，冷卻、4℃存放24小時以上。後用G6無菌過濾，收集濾出液，立即超濾，收集截留分子量1萬以下液體，無菌分裝、熱原試驗、質檢。其缺點是：（1）生產周期長，設備投資大，生產效率低；在pH8.0、47±0.5℃條件下胰酶水解30小時，生產周期長，容易受微生物污染，難於保證藥品質量；只用胰酶水解，水解並不完全，而且固液難於分離，生產過程中損耗大；使用減壓濃縮步驟，生產效率低，不利於對藥品質量的控制。（2）、使用大量的有機化學溶劑，丙酮和乙醚的沸點極低，是易燃、易爆、有毒的危險化學品，乙醚還被用作麻醉劑，使用大量的丙酮和乙醚先將腦蛋白沉澱出來製成腦蛋白粉，此步驟非常危險，必須在防爆車間內生產，操作煩瑣，污染環境，危害生產操作人員的身體健康。
發明內容
專利目的
《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》的目的在於提供一種新型的腦蛋白水解物生產方法，這種方法同2006年3月前已有的生產方法相比，具有生產環節收少、收率高、生產成本低且安全無污染。
技術方案
一種腦蛋白水解物的生產方法，該方法包括如下步驟：
（1）取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；
（2）將勻漿液分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，進行過濾，收集濾出液；
（3）將濾出液用羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化，調配肽圖，收集目標物；
（4）採用對分子截留為8千道爾頓的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、胺基酸分析；
（5）按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的編號為WS1-XG-25-2000藥品標準計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，即得注射用腦蛋白水解物的原液。
該發明還提供了一種腦蛋白水解物凍乾製劑的生產方法，該方法為：
（1）取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；
（2）將勻漿液分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，進行過濾，收集濾出液；
（3）將濾出液用羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化，調配肽圖，收集目標物；
（4）採用對分子截留為8千道爾頓的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、胺基酸分析；
（5）按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的編號為WS1-XG-25-2000藥品標準計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，得注射用腦蛋白水解物的原液；
（6）將注射用腦蛋白水解物原液與賦形劑及溶劑混均，用活性碳脫色經粗濾和精濾，分裝入西林瓶中；
（7）經過凍乾處理，得凍乾製劑。
改善效果
1、不使用丙酮、乙醚等化學危險品製備腦蛋白粉，新鮮或凍存豬腦直接經雙酶酶解等生產工藝提取腦蛋白水解物，具安全無污染、少投入生產設備、減少生產環節等優點。
2、雙酶水解腦組織勻漿液，採用抽取、殘渣離心獲得上清液，經過濾、上羥基磷灰石層析柱吸附分離純化，超濾等生產工藝，水解完全，可除去雜蛋白和大分子雜質，使HPLC雜質峰面積小於5％，達到2006年3月前已有工藝的分離效果。
3、採用雙酶酶解，抽取、殘渣離心獲得上清液，經過濾、上羥基磷灰石層析柱吸附分離純化，超濾等生產工藝，優點是生產步驟、周期大大縮短、收率提高、生產成本降低、生產環境要求降低、操作簡便，減少了藥品受微生物污染、變質的機會。該工藝穩定可靠，符合GMP要求。
附圖說明
圖1為注射用腦蛋白水解物凍乾曲線。
圖2為腦蛋白水解物注射液鑑別圖譜。
圖3為注射用腦蛋白水解物鑑別圖譜。
權利要求
1、一種腦蛋白水解物的生產方法，該方法包括如下步驟：
（1）取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；
（2）將勻漿液分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，進行過濾，收集濾出液；
（3）將濾出液用羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化：羥基磷灰石層析柱裝柱後先用400毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液清洗，再用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液平衡，將上述濾出液上羥基磷灰石層析柱進行吸附，用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液洗脫；
（4）收集目標物，採用對分子截留為8千道爾頓的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、胺基酸分析檢驗；
（5）按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的編號為WS1-XG-25-2000藥品標準計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，即得注射用腦蛋白水解物的原液。
2、一種腦蛋白水解物凍乾製劑的生產方法，該方法為：
（1）取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦，用膠體磨勻漿，收集勻漿液；
（2）將勻漿液分別用胃蛋白酶、胰酶水解，收集水解上清液，進行過濾，收集濾出液；
（3）將濾出液用羥基磷灰石層析柱進行吸附分離純化：羥基磷灰石層析柱裝柱後先用400毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液清洗，再用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液平衡，將上述濾出液上羥基磷灰石層析柱進行吸附，用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液洗脫；
（4）收集目標物，採用對分子截留為8千道爾頓的濾膜進行超濾，收集濾出液，進行定氮、胺基酸分析檢驗；
（5）按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的編號為WS1-XG-25-2000藥品標準計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，得注射用腦蛋白水解物的原液；
（6）將注射用腦蛋白水解物原液與賦形劑及溶劑混均，用活性碳脫色經粗濾和精濾，分裝入西林瓶中；
（7）經過凍乾處理，得凍乾製劑。
3、如權利要求4所述的腦蛋白水解物凍乾製劑的生產方法，其特徵在於：所述的賦形劑為甘露醇，溶劑為注射用水，以總氮30克的注射用腦蛋白水解物原液加240克甘露醇，再加注射用水至4000毫升。
4、如權利要求4或5所述的腦蛋白水解物凍乾製劑的生產方法，其特徵在於：所述的凍乾處理過程為先降溫至-38℃，維持3小時，然後抽真空，達到14帕後，開始升溫至5℃，維持10小時；再維持真空度14帕，升溫至15℃，維持15小時；進一步維持真空度14帕，升溫至25℃，維持3小時；壓塞，恢復大氣壓，出箱。
實施方式
實施例1、注射用腦蛋白水解物（原液）的生產
取經檢驗合格的新鮮或凍存健康豬腦100.0千克，去除結締組織及碎骨等非腦組織物，用注射用水洗淨，瀝乾，先用絞肉機絞成碎塊，用調節刻度至200目的膠體磨磨細，收集勻漿液，加入150.0千克（1.5倍重）的注射用水攪勻。將漿液加溫至42℃±2℃，用4.5％鹽酸調pH至1.5～1.7，按每千克漿液加入10克胃蛋白酶的比例（1％），加入2.5千克胃蛋白酶，維持pH1.5～1.7、42℃±2℃的條件水解8小時。用5摩爾/升NaOH將胃蛋白酶水解漿液調pH至7.1～7.3，按每千克漿液加入10克胰酶的比例（1％），加入2.5千克胰酶，攪勻後，維持在pH7.5～7.7、42℃±2℃水解4小時，酶解結束後加熱升溫至100℃，保溫15分鐘後，降溫至30℃以下。用4.5％鹽酸調pH2.8～3.0，靜置過夜。抽濾得上清液176.0千克，殘渣用離心機離心，收集上清液的53.0千克，合併上清液，共229.0千克，進行粗過濾，收集濾出液得227.0千克，用5摩爾/升NaOH調pH至6.8～7.0，備用。用注射用水將羥基磷灰石調成糊狀，採用淤漿式法裝柱，裝柱壓力0.5兆帕。裝柱後先用400毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液清洗，再用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液平衡，將上述濾出液上羥基磷灰石層析柱進行吸附，用20毫摩爾/升pH6.8磷酸鹽緩衝液洗脫。收集目標物得285.0千克，用對分子截留為8K的濾膜進行超濾，收集濾出液得274.0千克，進行肽圖、胺基酸檢驗。按國家藥品監督管理局2000年12月28日頒布的藥品標準（編號WS1-XG-25-2000）計算胺基酸用量，添加相應胺基酸配製成濃配液，0.22微米濾膜進行精過濾，即得注射用腦蛋白水解物的原液292.0千克。該原液可按凍乾製劑處方製備成品。
在100千克投料量情況下，得到的腦蛋白水解物原液總氮量為5069.12克，高於2006年3月前已有技術2636.48克，表明收率約提高了約93％。
實施例2、注射用腦蛋白水解物凍乾劑的生產方法
（1）原輔料的準備
在10000級潔淨區內，將全檢合格的腦蛋白水解物原液和甘露醇按處方量加入配液罐中，加入注射用水至刻度，充分攪拌混勻，按液體量0.2％加入活性碳，攪拌脫色20分鐘，0.45微米膜粗濾，再經0.22微米膜精濾，測其含量，送入100級分裝間，待用。
處方為：腦蛋白水解物原液約相當於總氮30.0克、甘露醇240克、注射用水加至4000.0毫升、分裝成1000瓶；處方中，腦蛋白水解物原液為主藥，甘露醇為賦型劑，注射用水為溶劑。
（2）包裝材料的準備
①西林瓶的準備：7毫升西林瓶經超音波清洗後，接著分別用去離子水、注射用水洗滌，再用潔淨壓縮空氣吹乾，最後在0.5小時內通過溫度達280-300℃的隧道烘箱滅菌和去除熱原，待用。
②丁基膠塞的準備：丁基膠塞先分別用去離子水洗淨，接著用注射用水反覆漂洗，然後在121℃條件下濕熱滅菌20分鐘，之後，真空抽盡水蒸氣，冷涼，待用。
③鋁蓋的準備：鋁蓋經純化水清洗後，在120℃條件下乾熱150分鐘，待用。
（3）分裝，半壓塞
分裝調試機器正常後，將經洗淨烘乾滅菌冷涼的空瓶送入分裝間，根據含量確定分裝體積，按注射劑分裝規程進行分裝，半壓塞。
（4）凍乾：將分裝好樣品的7毫升西林瓶送入凍乾箱中，按圖1所示的注射用腦蛋白水解物特定的凍乾曲線進行凍乾操作，凍乾結束後，將膠塞完全壓入西林瓶中。
凍乾過程為：1、分裝後，降溫至-38℃，維持3小時；2、抽真空，達到14帕後，開始升溫至5℃，維持10小時；3、維持真空度14帕，升溫至15℃，維持15小時；4、維持真空度14帕，升溫至25℃，維持3小時；5、壓塞，恢復大氣壓，出箱。6、凍乾全過程約需34小時。
（5）軋蓋：將凍幹完畢的半成品進行軋蓋，同時取樣全檢。
（6）目檢：軋蓋的同時，進行目檢，剔除外觀不合格品。
（7）貼簽：將目檢合格的半成品按貼簽操作規程貼上瓶簽。
（8）外包裝：貼簽結束，產品全檢合格後，裝小盒，中盒、大箱，然後入庫。
（9）鑑別圖譜：採用儀器型號為SPD-10AvpLC-10Atvp，檢測器類型為紫外，檢測波長為280納米，柱型號為TSK-GELG2000SWxl，柱溫為30℃，進樣量為10微升，流量為0.5毫升/分鐘。標準品腦蛋白水解物注射液（施普善）的鑑別圖譜分析圖譜見圖1，分析結果見表1。
峰號 | 保留時間 | 面積 | 高度 | 面積/高度 | 面積百分含量 | 分離度 | 拖尾因子 | 理論塔板 |
1 | 11.003 | 5582961.0 | 63007.9 | 88.607 | 14.6481 | 0.586 | 0.613 | 1244.4 |
2 | 11.462 | 863853.5 | 42098.7 | 20.520 | 2.2665 | 0.586 | 0.576 | 20338.4 |
3 | 11.562 | 658878.1 | 42833.4 | 15.382 | 1.7287 | 0.371 | 0.861 | 44386.4 |
4 | 11.833 | 6667307.9 | 187331.7 | 35.591 | 17.4931 | 0.864 | 1.637 | 13373 |
5 | 12.478 | 973114.7 | 22058.9 | 44.114 | 2.5532 | 1.121 | 1.432 | 4472.6 |
6 | 12.899 | 481741.3 | 13227.8 | 36.419 | 1.264 | 0.648 | 1.213 | 8594.3 |
7 | 13.328 | 429835.7 | 15226.5 | 28.229 | 1.1278 | 0.842 | 0.579 | 13092.8 |
8 | 13.662 | 21875547.9 | 825916.7 | 26.486 | 57.3952 | 0.838 | 1.197 | 27192.4 |
9 | 14.549 | 326090.3 | 7275.7 | 44.819 | 0.8556 | 1.824 | 1.602 | 8156.9 |
10 | 15.258 | 8797.4 | 358.5 | 24.538 | 0.0231 | 1.477 | 1.078 | 37012 |
11 | 16.024 | 157978.5 | 4837.2 | 32.659 | 0.4145 | 2.048 | 1.453 | 21876.6 |
12 | 16.649 | 49549.5 | 1263.1 | 39.229 | 0.1300 | 1.273 | 1.008 | 14613.6 |
13 | 18.083 | 32036.2 | 638.5 | 50.175 | 0.0841 | 2.265 | 0.91 | 10147.8 |
14 | 21.387 | 6188.9 | 167.1 | 37.026 | 0.0162 | 5.776 | 1.45 | 39744.1 |
合計： | 38113880.6 | 1226241.6 | 100.0000 | |||||
注射用腦蛋白水解物凍乾製劑的鑑別圖譜如圖2所示，分析結果見表2。
峰號 | 保留時間 | 面積 | 高度 | 面積/高度 | 面積百分含量 | 分離度 | 拖尾因子 | 理論塔板 |
1 | 10.724 | 4548004.4 | 62996.5 | 72.195 | 8.2537 | 0.451 | 0.542 | 2304.3 |
2 | 11.083 | 5093670.3 | 118388.7 | 43.025 | 9.2439 | 0.451 | 1.057 | 4015.1 |
3 | 11.487 | 1134172.6 | 56429.2 | 20.099 | 2.0583 | 0.813 | 0.724 | 23868.3 |
4 | 11.666 | 1052773.8 | 60484.2 | 17.406 | 1.9106 | 0.651 | 0.600 | 33508.8 |
5 | 11.937 | 10286309.2 | 252340.5 | 40.764 | 18.6675 | 0.735 | 1.424 | 9718.2 |
6 | 12.574 | 2804228.5 | 71305.1 | 39.327 | 5.0891 | 1.238 | 1.398 | 8421.9 |
7 | 12.995 | 598761.0 | 21109.9 | 28.364 | 1.0866 | 0.874 | 1.341 | 15480.4 |
8 | 13.416 | 1495231.4 | 51587.2 | 28.985 | 2.7135 | 1.057 | 0.680 | 19842.8 |
9 | 13.753 | 27582382.0 | 992560.5 | 27.789 | 50.0562 | 0.943 | 1.216 | 26640.0 |
10 | 16.120 | 140991.4 | 4006.6 | 35.190 | 0.2559 | 5.818 | 0.963 | 18145.5 |
11 | 16.645 | 361872.2 | 9496.8 | 38.105 | 0.6567 | 1.111 | 1.173 | 20173.6 |
12 | 19.174 | 4451.7 | 150.9 | 29.499 | 0.0081 | 6.080 | 1.480 | 44062.2 |
合計： | 55102848.3 | 1700856.0 | 100.0000 | |||||
通過圖1與圖2對比及表1與表2對比可知，注射用腦蛋白水解物凍乾製劑與與標準樣品的色譜圖基本一致，符合標準。
榮譽表彰
2014年11月6日，《腦蛋白水解物及其凍乾製劑的生產方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。
