胞外轉錄反應

限制酶內切好的質體DNA經phenol/chloroform萃取的後，即可用來進行胞外轉錄反應。

基本介紹

• 中文名：胞外轉錄反應
• 含有：由數個次單元組合而成
• 多胜肽 ：polypeptides
• 限制：酶內切好的質體

由於RNA聚合酶一般由數個次單元組合而成，早先要在試管內套用RNA聚合酶的轉錄活性合成RNA並非易事，但這個問題在SP6, T3 及T7 等噬菌體的RNA聚合酶陸續被發現以後，情況已完全改觀。這主要是因為這類RNA聚合酶由一條多胜肽 （polypeptides） 所構成，其在進行轉錄反應時所須辨認的啟動子長度僅20bp左右，而且轉錄起始位置非常明確，轉錄效能良好，成了目前進行胞外轉錄反應時的最佳選擇。要進行胞外轉錄反應時，僅需將目標基因次選殖 （subclone）至帶有SP6, T3 或T7 啟動子的轉錄載體，或者運用PCR技術在基因的一端加上SP6, T3 或T7 啟動子的序列，即可運用對應的RNA聚合酶活性在試管內合成正意股或反意股RNA. 以質體DNA為模版進行胞外轉錄反應前，應先用限制酶自目標基因的一端切開，以免轉錄反應持續進行至載體的序列 （run-on），但在選擇限制酶切位時應避免使用目標基因也帶有的切位；限制酶內切好的質體DNA經phenol/chloroform萃取的後，即可用來進行胞外轉錄反應。