維生素B2（vitamin B2）屬水溶性維生素，動物性食品中含量較高。缺乏維生素B2時許多酶的活性降低，線粒體中氧化速率下降，直接影響了能量代謝。肉與肉製品中維生素B2的測定主要有高效液相色譜法和比色法兩種。
基本介紹
- 中文名：肉與肉製品：維生素B2含量測定
- 外文名：Meat and Meat Products-Determination of Vitamin B2 Content
高效液相色譜法,原理,試劑,儀器和設備,取樣,試樣製備,分析步驟,計算,精密度,比色法,原理,試劑,儀器和設備,取樣,試樣製備,分析步驟,計算,精密度,
高效液相色譜法
原理
試樣用稀酸經121℃～123℃高壓釜處理，提取維生素B2（核黃素），過濾後，用高效液相色譜儀測定儀，保留時間定性，外標法定量。
試劑
如無特別說明，所有試劑均為分析純。
（1）水：符合GB/T 6682-2008規定的一級水。
（2）冰乙酸。
（3）甲醇：色譜純huo經重蒸。
（4）鹽酸溶液（0.1mol/L）：吸取2.1mL鹽酸（ρ20≈1.19g/mL），用水稀釋至250mL，混勻。
（5）氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取10g氫氧化鈉，溶於水中，用水稀釋至250mL。
（6）乙酸溶液（0.02mol/L）：吸取1.14mL冰乙酸，用水稀釋至1L。
（7）乙酸鈉溶液（0.05mol/L）：稱取3.4g三水乙酸鈉，溶於水中，用水稀釋至500mL，冰乙酸調pH為4.5。
（8）精密pH試紙：範圍3.8-5.4。
（9）維生素B2標準溶液
標準儲備液（100ug/mL）：稱取50.0mg維生素B2標準品，用乙酸溶液（0.02mol/L）溶解，並至500mL定容棕色容量瓶中（可在水浴上加熱溶解，冷卻後再定容）。
標準工作液（0.5ug/mL）：吸取標準儲備液（100ug/mL）1.00mL於100mL棕色容量瓶中，用乙酸溶液（0.02mol/L）定容，混勻，吸取此溶液5.00mL於100mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，臨用時配置。
儀器和設備
實驗室常規儀器及下列儀器。
（1）機械設備：用於試樣的均質化，包括高速旋轉的切割機，或多孔板的孔徑不超過4mm的絞肉機。
（2）高壓釜：溫度可控制在121℃～123℃。
（3）高效液相色譜儀：帶紫外或螢光檢測器。
取樣
實驗室所收到的樣品應具有代表性且在運輸和儲藏過程中無受損或發生變化。
取樣方法參見GB∕T 9695.19。
取有代表性的樣品200g。
試樣製備
使用適當的機械設備將試樣均質。注意避免試樣的溫度超過25℃。若使用絞肉機，試樣至少通過該設備兩次。
將試樣裝入密封的容器里，防止變質和成分變化。試樣應在均質化後24h內儘快分析。
分析步驟
（1）試樣處理
稱取試樣5g（準確至0.001g）於250mL具塞錐形瓶中，加入鹽酸溶液（4.4）10mL，塞好瓶蓋，用力振搖。用鹽酸溶液沖洗瓶壁，總體積約為60mL。將錐形瓶放入121℃～123℃高壓釜中加熱30min，取出冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調pH為4.0～4.5，使蛋白質沉澱後，轉移至500mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，過濾，濾液避光備用。濾液經0.45μm濾膜過濾後待測。
（2）測定
液相色譜參考條件
a）色譜柱：C18柱（150mm×4.6mm，5μm），或相當者；
b）流動相：甲醇+0.05moI/L乙酸鈉溶液（pH 4.5）=35+65（體積比）；
c）流速：1.0mL/min；
d）柱溫：30℃；
e）檢測波長：激發波長為440nm，發射波長為565nm；
f）進樣量：20μL。
根據試樣溶液中的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液。標準工作液和試樣溶液中維生素B2的回響維生素B2值均應在儀器檢測線性範圍內。標準工作液和試樣溶液等體積間隔進樣測定。根據保留時間定性，外標法定量。標準色譜圖參見附圖。
（3）平行試驗
按試樣處理和分析步驟對同一試樣進行測定。
（4）空白實驗
除不加入試樣外，均按試樣處理和分析步驟進行測定。
計算
X：試樣中維生素B2的含量（mg/100g）；
c：標準工作液中維生素B2的濃度（ug/mL）；
A：試樣中維生素B2的峰面積；
V：試樣溶液的最終定容體積（mL）；
Ai：標準工作液中生素B2的峰面積；
m：試樣質量（g）。
計算結果應扣除空白，結果準確至0.01mg/100g。
精密度
同一分析者在同一實驗室採用相同的方法和相同的儀器，在短時間間隔內對同一樣品獨立測定兩次，兩次測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。
比色法
原理
試樣用稀酸經121℃～123℃高壓釜處理，提取維生素B2（核黃素），維生素B2在中性或酸性溶液中經照射產生藍色螢光，螢光強度與維生素B2的濃度成正比，以此測定維生素B2的含量。
試劑
如無特別說明，所有世紀均為分析純。
（1）水：符合GB/T 6682規定的三級水。
（2）連二亞硫酸鈉。
（3）高錳酸鉀溶液（40g/L）：稱取4g高錳酸鉀，溶於水中用水稀釋至100mL。
（4）3%過氧化氫溶液：取10mL 30%過氧化氫，用水稀釋至100m。
（5）冰乙酸
（6）鹽酸溶液（0.1mol/L）：吸取2.1mL鹽酸（ρ20≈1.19g/mL），用水稀釋至250mL，混勻。
（7）氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取10g氫氧化鈉，溶於水中，用水稀釋至250mL。
（8）乙酸溶液（0.02mol/L）：吸取1.14mL冰乙酸，用水稀釋至1L。
（9）精密pH試紙：範圍3.8-5.4。
（10）維生素B2標準溶液
標準儲備液（100ug/mL）：稱取50.0mg維生素B2標準品，用乙酸溶液（0.02mol/L）溶解，並至500mL定容棕色容量瓶中（可在水浴上加熱溶解，冷卻後再定容）。
標準工作液（0.5ug/mL）：吸取標準儲備液（100ug/mL）1.00mL於100mL棕色容量瓶中，用乙酸溶液（0.02mol/L）定容，混勻，吸取此溶液5.00mL於100mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，臨用時配置。
儀器和設備
實驗室常規儀器及下列儀器。
（1）螢光分光光度計。
（2）機械設備：用於試樣的均質化，包括高速旋轉的切割機，或多孔板的孔徑不超過4mm的絞肉機。
（3）高壓釜：溫度可控制在121℃～123℃。
取樣
實驗室所收到的樣品應具有代表性且在運輸和儲藏過程中無受損或發生變化。
取樣方法參見GB∕T 9695.19。
取有代表性的樣品200g。
試樣製備
使用適當的機械設備將試樣均質。注意避免試樣的溫度超過25℃。若使用絞肉機，試樣至少通過該設備兩次。
將試樣裝入密封的容器里，防止變質和成分變化。試樣應在均質化後24h內儘快分析。
分析步驟
（1）試樣處理
稱取試樣5g（準確至0.001g）於250mL具塞錐形瓶中，加入鹽酸溶液（4.4）10mL，塞好瓶蓋，用力振搖。用鹽酸溶液沖洗瓶壁，總體積約為60mL。將錐形瓶放入121℃～123℃高壓釜中加熱30min，取出冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調pH為4.0～4.5，使蛋白質沉澱後，轉移至500mL棕色容量瓶中，用水定容，混勻，過濾，濾液避光備用。濾液經0.45μm濾膜過濾後待測。
（2）測定
吸取備用濾液和維生素B2標準工作液（0.5ug/mL）各10.0mL，分別置於兩支25mL棕色試管中，加入冰乙酸1.00mL。在不斷搖動下加入高錳酸鉀溶液（40g/L）4滴，使溶液顯紫色，靜置2min，滴加過氧化氫溶液兩滴，搖勻，使紫色在10s內褪去。
於激發波長440nm，發射波長565nm處，用螢光分光光度計測定其螢光強度I和I`。
在各試管中分別加入二亞硫酸鈉20mg，輕搖，10s內測其最小螢光強度Q和Q`。
計算
X：試樣中維生素B2的含量（mg/100g）；
I：試樣溶液的螢光強度；
Q：試樣溶液加連二亞硫酸鈉後的螢光強度；
I`：維生素B2標準工作液的螢光強度；
Q'：維生素B2標準工作液加連二亞硫酸鈉後的螢光強度；
c：維生素B2標準工作液的濃度（ug/mL）；
m：試樣質量（g）。
計算結果準確至0.01mg/100g。
精密度
同一分析者在同一實驗室採用相同的方法和相同的儀器，在短時間間隔內對同一樣品獨立測定兩次，兩次測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。
