《聚羥基丁酸途徑增強Klebsiella pneumoniae抗逆性機理研究》是依託清華大學，由劉宏娟擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：聚羥基丁酸途徑增強Klebsiella pneumoniae抗逆性機理研究
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：劉宏娟
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
3－羥基丙醛積累造成細胞死亡，發酵異常終止是生物法生產1,3-丙二醇過程中的關鍵問題。申請者在前期工作基礎上，不同於以往降低3－羥基丙醛積累的研究思路，從增強菌株自身抗逆性出發，將聚羥基丁酸（PHB）途徑引入Klebsiella pneumoniae，研究PHB途徑對細胞代謝的擾動規律，探討PHB積累與菌株抗逆的相關性；研究rpoS基因對細胞PHB代謝的調節機制，考察PHB積累對細胞DNA合成的影響，揭示PHB積累增強菌株抗逆性的內源因素；結合蛋白組學分析及基因差異分析研究PHB積累對K.pneumoniae蛋白合成的調節機制，從而闡明PHB途徑增強K. pneumoniae抗逆性機理。本研究結果可為耐高濃度3-羥基丙醛菌種的進一步改造及最佳化提供理論依據；對解決3-羥基丙醛積累造成1,3-丙二醇發酵過程異常中斷的難題具有重要的理論指導意義。
結題摘要
3-羥基丙醛（3-HPA）積累造成細胞死亡，發酵異常終止是生物法生產1,3-丙二醇（PDO）過程中的關鍵問題。本項目研究了3-HPA對克雷伯氏菌代謝的影響及聚羥基丁酸（PHB）路徑的引入增強克雷伯氏菌抗逆性的機理。 首先研究了克雷伯氏菌對3-HPA的耐受性並探討了其酶學機理。低濃度3-HPA積累可促進菌體生長；高濃度3-HPA積累時，甘油脫水酶活力提高一倍，甘油脫氫酶和PDO氧化還原酶活力降低了33.3%和37.5%，從而導致3-HPA積累。以選育的PDO高產菌為模式菌株，最佳化了phbCAB基因的表達並獲得穩定轉化子，工程菌耐3-HPA濃度可達 10.8 mmol/L。 研究了PHB路徑對克雷伯氏菌代謝的擾動，並對關鍵節點代謝流分布進行了差異分析。PHB路徑引入後，一部分碳流量流向了PHB合成，而流向細胞前體物質合成的流量減少。PHB路徑主要影響節點丙酮酸（PYR）和乙醯輔酶A (AcCOA)的代謝流分布。節點PYR流向乳酸合成的碳流量增加了1.79倍，而流向2,3-丁二醇和AcCOA的碳流量則分別下降了22%和14.4%。在節點AcCOA，流向乙醇合成的流量增加了42.8%，而流向乙酸合成的流量降低了12.4%。 結合代謝流分析和酶活分析的結果，進行了ldhA基因敲除，同時轉入phbCAB基因。流加發酵48h，工程菌PDO產量較對照提高8.6%，無乳酸合成。ldhA 基因敲除後，PHB路徑主要影響節點甘油和AcCOA的代謝流分布。在節點甘油處，流向PDO合成的碳流量增加了5%，而流向生物量和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成降低了10.7%和7.5%。在節點AcCOA，流向乙醇合成的碳流量增加了20.1%，而流向乙酸合成的則降低了6.9%。 ldhA基因敲除後，部分NADH2為PDO所利用，因此在保持較高抗逆性的同時PDO的合成也得到了促進。 進行了蛋白組學研究以進一步了解雷伯氏菌對3-HPA的耐受機制，高濃度3-HPA積累時，出現3倍差異蛋白14個，新出現蛋白15個，與糖酵解途徑，甘油脂代謝，醇代謝等途徑相關。高濃度3-HPA積累時，顯著上調的蛋白有3-磷酸甘油脫氫酶，PEP合酶，葡萄糖磷酸變位酶。相反，腺苷鈷胺依賴的二醇脫水酶，甘油脫氫酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸丙酮酸水合酶顯著下調。研究結果為耐高濃度3-HPA菌種進一步改造及最佳化提供了理論依據。
