基本介紹
- 中文名：聚合酶鏈反應(PCR)檢驗實驗室檢查要點指南（2016版）
- 發布時間：2016年9月
簡介,適用範圍,檢查要點,現場查看生產企業PCR檢驗實驗室布局,現場查看儀器設施配置,現場檢查工作流程及注意事項,現場檢查人員培訓情況,現場檢查檔案情況,資料來源,
簡介
聚合酶鏈反應檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗實驗室。聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引導下的鏈延伸反應三個階段的多次循環。每一次循環後的擴增產物均可作為下一輪循環的模板，理論上，擴增產物量呈指數形式上升，即經過n個循環後，產物量增加到2倍。PCR試劑操作簡單，短時間內在體外可獲得數百萬個特異靶DNA序列的複製，為臨床疾病的診斷、治療監測和預後評估提供了一種極有幫助的實驗室輔助手段。
PCR檢驗實驗室是PCR試劑生產企業在產品檢驗過程中不可缺少的工作環境，其環境控制水平和質量管理水平直接影響著最終產品是否合格，能否放行。由於該產品本身的特殊性，《醫療器械生產質量管理規範附錄體外診斷試劑》、《醫療器械生產質量管理規範體外診斷試劑現場檢查指導原則》條款中，明確對PCR試劑的生產和檢驗環境做出規定。此外現行衛生行業的法規、標準以及相關文獻中對於PCR檢驗實驗室均作出規定，主要涉及《全國臨床檢驗規程》（第三版）、《醫療機構臨床基因擴增管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》及《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的套用》（WS/T 230-2002）等行業標準的相關要求。
本檢查指南旨在幫助北京市醫療器械監管人員增強對PCR檢驗相關過程的認知和把握，指導全市醫療器械監管人員對PCR檢驗實驗室設計建設與質量控制的監督檢查工作。同時，為PCR試劑生產企業在PCR檢驗實驗室的設計建造和管理要求提供參考。
當國家相關法規、標準、檢查要求發生變化時，應當重新討論以確保本檢查指南持續符合要求。
適用範圍
本檢查指南可作為北京市食品藥品監督管理局組織、實施的體外診斷試劑產品註冊質量管理體系現場核查、《醫療器械生產許可證》現場核查、醫療器械生產監督檢查等各項涉及PCR檢驗實驗室檢查的參考資料。
基因測序檢驗實驗室等涉及PCR試劑的相關部分應當參照本檢查指南執行。
檢查要點
現場查看生產企業PCR檢驗實驗室布局
生產企業應當提供PCR檢驗實驗室設計方案和/或平面設計圖（應當標明風向或壓差梯度）。
1.PCR檢驗實驗室與PCR試劑生產區域應當在各自獨立的建築物或空間內，保證空氣不直接聯通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。
2.原則上PCR檢驗實驗室應當設定以下區域：試劑儲存和準備區、標本製備區、擴增區、擴增產物分析區。根據使用儀器的功能，區域可適當合併。若使用實時螢光定量PCR儀且不需要進行後續產物分析工作，擴增區、擴增產物分析區可合併。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本製備區、擴增區、擴增產物分析區可合併。
3.各區域在物理空間上應當完全相互獨立，各區域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處於完全的分隔狀態。不應當只是形式上的分區，不應當是一個區域嵌套一個區域。
4.各區域不應當有空氣的直接相通。擴增區與擴增產物分析區各區域宜採用獨立直排方式出風。採用空調機組方式的，PCR檢驗實驗室應當具備獨立空調機組；同時應當考慮停機後各房間空氣連通的可能性，採取必要的控制措施。
5.按照試劑儲存和準備區→標本製備區→擴增區→擴增產物分析區方向空氣壓力應當以遞減的方式進行，使得PCR檢驗實驗室的空氣流向應當按照試劑儲存和準備區→標本製備區→擴增區→擴增產物分析區方向進行，防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區域。空氣流向應當為單向，禁止下游污染上游。應當設定合理的壓差梯度，並安裝壓差監測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低於5帕。
6.設定緩衝間的，緩衝間內通向內實驗室和走廊的門應當安裝連鎖裝置或採取相應措施，避免出現兩個門同時打開的情況。
7.各區間若設定傳遞窗，應當為雙側開門，要求密封嚴實，並且兩側的門應當為互鎖裝置或採取相應措施保證兩側門不會同時開啟。
現場查看儀器設施配置
1.試劑儲存和準備區的功能：貯存試劑的製備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。
配套用品一般應當包括：
（1）溫度調控範圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰櫃；
（2）混勻器；
（3）微量加樣器；
（4）紫外消毒設備；
（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；
（6）專用工作服和工作鞋(套)；
（7）專用辦公用品。
2.標本製備區的功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及加樣。
配套用品一般應當包括：
（1）溫度調控範圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰櫃；
（2）高速離心機；
（3）混勻器；
（4）水浴箱或加熱模組；
（5）微量加樣器；
（6）紫外消毒設備；
（7）生物安全櫃；
（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）；
（9）專用工作服和工作鞋(套)；
（10）專用辦公用品；
（11）如需處理大分子DNA，應當具有超音波儀。
3.擴增區的功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。配套用品一般應當包括：
（1）核酸擴增儀；
（2）微量加樣器；
（3）紫外消毒設備；
（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和
加樣器吸頭（帶濾芯）；
（5）專用工作服和工作鞋；
（6）專用辦公用品。
4.擴增產物分析區的功能：擴增片段的進一步分析測定。視檢驗
方法不同而定，基本配置如下：
（1）微量加樣器；
（2）紫外消毒設備；
（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；
（4）專用工作服和工作鞋；
（5）專用辦公用品。
5.設備的維護保養
應當建立設備維護保養規程，計量設備應當定期檢定。例如核酸擴增儀、微量加樣器、生物安全櫃、離心機應當每年進行檢定或校準工作。
現場檢查工作流程及注意事項
1.進入各工作區域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區→標本製備區→擴增區→ 擴增產物分析區。
2.各工作區域必須有明確的標記，不同工作區域內的設備、物品不得混用。
3.不同工作區域的工作服應當加以區分，不得混用（例如可以採用不同顏色）。
4.實驗室的清潔應當按照試劑貯存和準備區→標本製備區→擴增區→擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具並防止交叉污染。實驗垃圾屬於醫療廢物的應當按照《醫療廢物管理條例》相關規定進行處理。
5.工作結束後，應當立即對工作區進行清潔及消毒。
6.貯存試劑和用於標本製備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過擴增檢測區。應當對加樣吸頭、PCR反應管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品及質控品應當保存在標本處理區。試劑應當使用分子生物學級別試劑，使用的純化水應當高壓滅菌。質檢用於原輔料、半成品、成品檢驗用的PCR反應試劑應當有相應的質量標準及操作程式。
7.為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸後，應當蓋好含反應混合液的反應管。應當注意PCR反應液加樣的順序，應當為空白樣品→陰性對照→樣品→陽性對照。對具有潛在傳染危險性的材料，應當在生物安全櫃內開蓋，並有明確的樣本處理和滅活程式。
8.應當避免氣溶膠所致的污染，儘量減少在擴增區內的走動，擴增反應管不得在擴增區打開。
現場檢查人員培訓情況
參與PCR檢驗的工作人員應當具備相應的專業知識和技能，包括能熟練操作相關設備,明確整個工作的流程,掌握出現污染情況的處理方法以及實驗室質量控制方法和檢測結果的解釋。
檢查人員可以通過詢問或要求人員實際操作對其進行評價，也可以通過查閱人員培訓記錄，對其進行評價。
現場檢查檔案情況
在檢查過程中應當特別注意現場查看、詢問、記錄的實際情況與生產企業的檔案規定、記錄的符合性。
附屬檔案如下：
理想的PCR檢驗實驗室設計
圖A 緩衝間為負壓的理想PCR檢驗實驗室設定模式
圖B 緩衝間為正壓的理想PCR檢驗實驗室設定模式
圖A和圖B所給出的PCR檢驗實驗室設定圖是較為理想的設定模式，建議企業參照此種模式設計並建立實驗室。
資料來源
1.《關於發布醫療器械生產質量管理規範的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第64號）
2.《關於發布醫療器械生產質量管理規範附錄體外診斷試劑的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2015年第103號）
3.《關於印發醫療器械生產質量管理規範現場檢查指導原則等4個指導原則的通知》（食藥監械監〔2015〕218號）
4.《生物安全實驗室建築技術規範》（GB50346-2004）
5.《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）
6.《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的套用》（WS/T203-2002）
7.全國臨床檢驗操作規程[第3版]，中華人民共和國衛生部醫政司，2006年11月2日
8.Setting Up a PCR Laboratory—Theodore E. Mifflin，Department of Pathology, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908
9.Establishment of PCR laboratory in developing countries—World Health Organization[SEA-HLM-419]
