耦合固定化

耦合固定化是指幾種固定化方法或載體的聯合使用，即添加穩定因子和促進因子的固定化方法。近年來耦合固定化技術發展迅速，在生物轉化、手性拆分和廢水處理等方面均有良好的套用實例。耦合固定化技術能夠平衡傳統單一固定化方法的優缺點，使酶在保持原有活性的基礎上，穩定性有所提高，還具有操作簡單、成本低廉等優點。

基本介紹

• 中文名：耦合固定化
• 外文名： co-immobilization
• 套用：生物轉化、手性拆分和廢水處理
• 優點：酶活性高、簡單、成本低
• 技術：吸附-交聯、共價結合-交聯等
• 特點：每活性、穩定性均較高

固定化技術經過三十多年的發展，克服了游離酶反應存在的分離困難、穩定性差和易流失等問題。但真正套用於工業化的固定化酶並不多，主要是因為固定化酶的過程中還存在幾個急待解決的難題:(1)酶的活性中心發生物理化學變化導致酶活力降低；(2)酶固定化後多了空間屏障，增加了傳質阻力；(3)酶和載體結合不牢固，容易脫落，酶活力損失大；(4)固定化顆粒成型困難。如何解決這些問題是固定化技術的熱點，研究者不斷地對固定化載體改良並提出新的載體和固定化方法，並在耦合固定化方面進行了大量的研究。

耦合固定化

耦合固定化是指幾種固定化方法或載體的聯合使用，即添加穩定因子和促進因子的固定化方法。近年來耦合固定化技術發展迅速，在生物轉化、手性拆分和廢水處理等方面均有良好的套用實例。耦合固定化技術能夠平衡傳統單一固定化方法的優缺點，使酶在保持原有活性的基礎上，穩定性有所提高，還具有操作簡單、成本低廉等優點。對幾種主要的耦合固定化技術進行簡單地介紹：

耦合固定化技術

吸附-交聯

吸附載體富含氨基或羥基，酶通過物理吸附或離子吸附作用與載體結合，結合力比較弱，高離子強度和高pH值下，容易解析造成酶的泄漏，一般不單獨使用。吸附-交聯法是目前使用較多的耦合方法，其中以先吸附後交聯的方法最為常見。交聯作用能夠增強酶和載體之間的作用力，避免單一吸附固定化酶易脫落造成產物污染的缺點，提高固定化酶的穩定性。JyotiLIyer等發現用純化的海沙固定環胡精葡萄糖苷轉移酶(CGTase)，雖然能夠達到98%的吸附率，但酶很容易從介質上脫落，而戊二醛的交聯增強了結合力，解決了這個問題，酶反應8批次後，仍然能夠維持80%的活性。VemuriG等研究發現蛋殼吸附，戊二醛交聯固定化脂肪酶的方法機械強度好，能夠抵擋較強的剪下力，比海藻酸包埋法更適合於催化攪拌罐中的油脂反應，能重複使用8批次。吸附介質和一些添加劑對酶有保護作用，能夠降低交聯的激烈程度。辛嘉英等以Al2O3為載體，在明膠的保護作用下，通過吸附交聯法固定化葡萄糖異構酶，酶活力由62.3%提高到92.6%，這是因為明膠中富含氨基基團，能替代酶表面的氨基和戊二醛的活性基團相互作用，緩解交聯的激烈程度。吸附-交聯法還具有操作簡單、吸附容量大、材料來源廣泛等優點。SouzaSFD等研究了一種用棉布做固定化載體的簡單技術，酶吸附在表面覆蓋有聚丙稀醯氨的棉布上，戊二醛交聯後即得到連續使用的固定化酶。邱廣亮等研究了磁性載體的吸附-交聯法固定酶的方法，磁性載體具有兩親性，適用於水相和有機相系統，並可通過簡單的磁場作用力實現酶的回收。戊二醛交聯增強了磁性載體的耐熱、酸、鹼性，同時存儲穩定性和操作穩定性也有所增強。

共價結合-交聯

共價結合法一般通過載體表面的基團與酶表面的基團如:氨基、羧基、巰基等相互作用實現固定化，結合比較牢固，基團之間有很強的選擇性。共價結合-交聯法能增強酶和載體間的作用力，並且通過交聯作用使載體結合更多的酶。ParkSeungWon等將GL-7ACA醯基轉移酶通過共價結合-交聯法固定在3-氨基丙烷基三乙氧基矽烷活化的矽膠上，酶活力可提高60%，反應20批後酶活力仍維持在70%以上。HungTien-Chieh等介紹了以殼聚糖為載體固定化脂肪酶的方法，首先用碳化二亞胺激活殼聚糖上的羥基，使酶共價結合到羥基上，再通過戊二醛在殼聚糖的氨基上交聯更多的酶，該固定化方法又稱“二元固定化法”。共價結合-交聯法也存在一些缺點，如操作比較複雜，需要對載體進行修飾和活化，酶和載體結合過程中反應激烈，容易造成酶失活。LeontievskyAA等在研究中發現，用共價結合-交聯法固定化漆酶，雖然能夠維持原有酶活力33天，但造成的酶活力損失可達50%。

絮凝固定化與其他方法的耦合

1977年，LongMargarete等提出絮凝固定化技術，用絮凝劑對細胞進行處理，將得到的絮團經離心、過濾、壓縮、乾燥等工藝，得到粒徑統一的固定化細胞顆粒。絮凝固定化具有條件溫和，酶活回收率高的優點，單一絮凝固定化的方法避免了將細胞從發酵液中分離的步驟，但操作過程也很複雜。如果用絮凝-吸附法將從發酵液(酶液)絮凝出的酶直接吸附到介質上，可簡化絮凝固定化的操作工序，並增加固定化酶的穩定性。NiveditaKamath等利用多聚電介質的絮凝能力將尿素降解細胞吸附在棉布介質上降解尿素，大大降低了傳統高壓分解釜分解尿素的費用，並適用於連續的操作。絮凝-包埋法的耦合能夠較好地解決絮凝固定化方法，但機械強度不好，酶在包埋介質中容易發生泄露。肖厚容等採用絮凝-包埋-交聯的方法，以脫乙醯殼聚糖為載體，明膠包埋，戊二醛為交聯劑，對胰蛋白酶進行了固定化處理，兼有絮凝固定化方法的快速方便，包埋法的成型容易和交聯強度大等優點。黎剛採用絮凝-PAM包埋的方法得到了活性較高的固定化微生物，絮凝劑的加入還起到保護細胞的作用，降低了PAM造成的酶活損失。

絮凝-交聯、絮凝-微囊法能夠有效地提高固定化載體的機械強度。LanteroJr等研究採用多聚電解質絮凝，戊二醛交聯耦合法固定化紅色精朊桿菌(protaminobacterruber)生產異麥芽酮糖。Cantwell等用絮凝-微囊法將含酶的假單孢菌(PeseudomonasPutida)、絮凝劑聚丙稀醯胺和丙稀丁二稀乳膠按2∶1∶1的比例混合，攪拌後可得具有較高機械強度的聚合微囊，其化學穩定性和生物穩定性都很好。

包埋固定化與其他方法的耦合

包埋法是固定化酶比較方便的方法，條件溫和，基本上不會改變酶的結構，細胞也不容易脫落，但主要存在機械強度差、酶易泄漏和傳質阻力較大。耦合固定化技術能夠很好地解決這兩個問題。包埋法使用的一些凝膠分子間隙較大，即使是分子量很大的酶也容易在其中發生疏漏，解決這個問題主要有兩個方法:一是用交聯或共價結合的方法處理包埋酶顆粒；二是將酶吸附在一些大分子顆粒上，增大酶分子的體積。BoadiDK等發現用包埋-交聯法固定單寧酸酶，能有效地提高酶活保留率。TanrisevenAziz等將葡萄糖澱粉酶吸附在凝膠化的玉米澱粉顆粒上，再用海藻糖包埋，解決了酶泄漏的問題。一些凝膠，如海藻酸鈣在含有磷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽以及鈉離、鎂離子的溶液中不穩定，能夠和鈣離子發生離子交換作用，導致膠體的膨脹。而用一種富含陽離子的物質和凝膠的酸根相互作用，能夠在載體表面形成保護膜，有利於包埋酶的穩定。海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊具有較好的穩定性和滲透性。王康等用海藻酸鈉和殼聚糖固定化脂肪酶，將其套用於有機相的反應，提高固定化酶的包埋率和穩定性，並且由於殼聚糖具有一定的疏水特性，這有利於疏水底物向酶分子周圍的擴散。

從較早的吸附-交聯法、包埋交聯法開始，耦合固定化技術已經得到越來越多的套用，先後提出並研究了包埋-吸附法、絮凝-吸附法、吸附-交聯法、膜-吸附法等方法。耦合技術為傳統的固定化方法注入了新的特點和活力，使固定化技術的套用前景更加廣闊。耦合固定化基本上能夠解決單一固定化方法酶活回收率低、穩定性差、傳質阻力差等問題，並具有方法多樣、操作簡便、技術成熟等特點。隨著人們對固定化酶微環境認識和研究的進一步加深，耦合固定化技術將逐步成為研究的熱點。