《耐鹽菌Bacillus sp.BG-CS10嗜鹽纖維素酶嗜鹽機制的研究》是依託湖北大學，由張桂敏擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：耐鹽菌Bacillus sp.BG-CS10嗜鹽纖維素酶嗜鹽機制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張桂敏
- 依託單位：湖北大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
嗜鹽微生物及其產生的嗜鹽酶的研究對嗜鹽微生物的利用和耐鹽嗜鹽酶的工業套用都具有重要的意義。我們已經通過改造的鳥槍法從耐鹽嗜鹼菌Bacillus sp. BG-CS10中克隆到一個新的纖維素酶基因，該基因包含一個纖維素酶結構域和一個未知功能結構域DUF291。異源表達和表征分析發現，2.5 M NaCl能使該纖維素酶的活性提高10倍，使酶的最適溫度提高20oC。這些明顯不同於已報導的其他纖維素酶。本課題擬繼續從三個方面研究該蛋白嗜鹽的機制。一是通過蛋白純化，結晶和X-衍射解析蛋白的結構，探索和嗜鹽相關的胺基酸殘基和可能的嗜鹽機制；二是研究未知功能結構域DUF291的功能和嗜鹽的關係。三是通過DLS，CD，NMR等方法研究含有2 M NaCl的CelB蛋白在不同溫度下的溶液行為以及鹽對其聚集和熱穩定性提高的影響。本課題的完成可能為纖維素酶向耐鹽方向的進化提供普遍的分子設計的理論基礎。
結題摘要
嗜鹽微生物及其產生的嗜鹽酶的研究對嗜鹽微生物和嗜鹽酶的工業套用都具有重要意義。研究嗜鹽纖維素酶的嗜鹽機制可為纖維素酶向耐鹽方向的進化提供分子設計的理論基礎。本項目通過改造的鳥槍法克隆到兩個鹽相關的纖維素酶基因，並進行了表征。宏基因組來源的纖維素酶CelA是一個鹽穩定的酶，3.0 M NaCl提高酶活兩倍。耐鹽嗜鹼菌BG-CS10的纖維素酶CelB，2.5 M NaCl提高酶活10倍。因此繼續對CelB進行深入研究，它由纖維素酶結構域和未知功能結構域DUF291組成，2.5 M NaCl也提高了酶的最適溫度20 ℃。通過摸索CelB純化方法與結晶條件，獲得了解析度達到2.5 Å的天然CelB晶體和Se-CelB晶體。X-衍射、結構分析表明，CelB由催化結構域、CBM_X和CBM46三個獨立的結構域構成，但是和大多纖維素酶不同的是，兩個纖維素結合結構域的去除直接造成酶的完全失活。三個結構域間無彈性蛋白鏈連線，其表面的芳香族胺基酸拓長了底物結合位點，三個結構域相互聯繫、缺一不可，共同形成一個緊密的L-構造。CBM_X結構域位於催化結構域右側，兩者依靠胺基酸之間的氫鍵作用力相互聯繫，並無經典的連線蛋白。另外，在CBM_X的N末端有一個特殊的環，它將CBM_X、催化結構域以及CBM46緊密聯繫起來。對其表面的芳香族胺基酸進行突變，酶活性受到一定影響，可能是參與了底物結合過程的原因。CBM46結構域是由一個很大的反向平行β摺疊構成的桶狀結構，整個結構的穩定主要靠氫鍵作用力和鹼基堆積力。其表面含有很多Try、Tyr和Phe，當去除這些胺基酸時，CelB酶活性會下降，說明這些胺基酸構成了碳水化合物的對接位點。CelB蛋白表面幾乎全是帶負電荷的酸性胺基酸，直接導致CelB的等電點下降，進而使其表現出嗜鹽的特性。溶液行為研究表明，纖維素酶CelB至少需要0.15 M NaCl才能保持酶蛋白的均一性；此外，通過動態光散射和小角散射發現含2 M NaCl的CelB在55 ºC時，會寡聚化成線性狀態，並且保持活性穩定，但是60ºC時，蛋白會變性，這可能是蛋白在變性前的溫度發生寡聚化通過群體效應抵抗熱變性。總之，通過該項目，已經掌握了嗜鹽纖維素酶CelB的酶學性質、晶體結構、耐鹽機制和溶液行為等，為纖維素酶向耐鹽方向的進化提供了分子設計的理論基礎。
