缺鐵誘導可變剪下的功能分析及其調控機制研究

《缺鐵誘導可變剪下的功能分析及其調控機制研究》是依託南京林業大學，由李文鳳擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：缺鐵誘導可變剪下的功能分析及其調控機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李文鳳
• 依託單位：南京林業大學

中文摘要

鐵是植物必需的微量元素，缺鐵會造成作物減產和品質下降，而過量會對細胞有毒害。植物通過複雜的調控網路來嚴格控制鐵的平衡。作為調控真核基因表達的重要機制，可變剪接（Alternative Splicing, AS）參與調控植物鐵平衡的研究在國內外尚屬空白。前期通過分析擬南芥轉錄組數據，發現缺鐵誘導產生特異性AS，推測AS可能參與缺鐵回響過程，但對缺鐵誘導AS的功能和產生機制還不清楚。本項目採用分子生物學、遺傳學和生物信息學等方法，進一步驗證和克隆缺鐵誘導差異表達的AS異構體，分析其生理功能和分子特性，並研究調控AS的順式元件和反式因子。通過本項目，有望挖掘功能性AS異構體，闡明其在缺鐵回響中的生理功能和可能的作用機制，並鑑定缺鐵誘導AS的調控因子，揭示缺鐵引發AS變化的分子機制。本項目的實施，將彌補當前對植物中AS認識的不足，完善對鐵平衡精細調控系統的理解，為培育富鐵農林作物品種提供新思路。

結題摘要

由於元素自身的化學屬性，鐵在植物體內既有不可或缺的功能，又受到嚴格的調控，以滿足正常生長發育的需求，同時又要避免累積過多造成的損害。因此，植物發展出精細複雜的調控系統來應對土壤中可利用鐵的動態變化。本項目主要調查可變剪接（Alternative Splicing, AS）如何參與調控植物的鐵平衡。首先分析了缺鐵誘導產生AS的62個基因，發現有12個基因產生了新剪接異構體，缺鐵條件下，部分基因的剪接模式發生改變；接著克隆了缺鐵誘導變化最顯著的GSTL3的2個新的AS異構體，AS-I1和AS-I6，後者由於引入了提前終止密碼子而可能編碼C-末端結構域缺失得截短蛋白；不同缺素處理實驗表明AS-I1和AS-I6受缺鐵特異誘導，且處理48小時後表達持續增強，顯示GSTL3的可變剪接與缺鐵應答密切相關；獲得了分別過量表達GSTL3的組成型（CS）和兩個可變剪接異構體的純合系擬南芥植株，RT-PCR結果表明，AS-I6的過表達引起組成型剪接本的含量升高；但是在正常和缺鐵條件下，野生型和各個過表達植株的根長、葉綠素含量以及鐵還原酶活性，均未發現明顯差異。 SR蛋白是調控可變剪接的重要因子，通過篩選擬南芥SR 基因家族成員的108 個T-DNA 插入突變體，獲得了16 個SR基因的缺失突變體純合系；分析正常和缺鐵條件下SR家族基因的表達譜發現，在15 個SR 基因中檢測到了80-90個轉錄本，顯示AS 極大地增加了SR 基因轉錄本的豐富度；儘管缺鐵對SR 基因的表達譜沒有明顯影響，但發現特定SR 基因的轉錄譜可能受到另外SR 基因的影響。更重要的是，定量PCR檢測sr突變體中AS-I1，AS-I6，CS中表達量，發現SR34和RSZ21可能參與調控GSTL3基因的可變剪接；進一步檢測了各個sr單突變體在正常和缺鐵條件下的表型，所有測試材料在正常和缺鐵條件下都與野生型表現相似；為了檢測SR基因間是否存在功能冗餘，進行了SR亞家族四個基因的突變體sr34 sr34a sr34b sr30在不同生長條件下的表型觀察，結果發現，sr34 sr34a sr34b sr30在正常條件下與野生型一樣，但在高鐵環境下表現為植株較小，葉片顏色更暗，與鐵累積造成毒害的症狀相似，表明SR亞家族可能參與缺鐵誘導的可變剪接調控。進一步的實驗還在進行中。