線粒體基因突變和喉癌發生髮展關係的研究

《線粒體基因突變和喉癌發生髮展關係的研究》是依託吉林大學，由趙明擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：線粒體基因突變和喉癌發生髮展關係的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：趙明
• 依託單位：吉林大學

項目摘要

在多種人類腫瘤細胞中，線粒體DNA具有高突變率和高拷貝數的特點，而在頭頸腫瘤中尤以線粒體D-loop區的突變頻率最高。在本研究中，我們將在癌前病變和原發喉癌組織中檢測線粒體D-loop區的突變，進行以PCR為基礎的直接測序，檢測各種組織的突變頻率，尋找高頻突變及熱點突變部位，分析突變的特點與喉癌發生髮展及預後的關係。利用篩選的高頻熱點突變和我們培養成功的獨一無二的無線粒體喉癌細胞株構建突變型和野生型的轉染線粒體的融合喉癌細胞株並接種裸鼠。通過對幾種融合細胞的線粒體功能檢測，包括線粒體膜電位、ROS產生、ATP合成、cytochromeC釋放及細胞凋亡狀態的檢測，探討線粒體D-loop突變對線粒體功能和喉癌細胞凋亡的影響及線粒體突變對喉癌細胞表型的作用，闡明我國喉癌發生髮展中的線粒體的基因改變的特點，證實線粒體缺陷是喉癌發生的機制之一及線粒體基因突變的檢測作為喉癌發生早期的分子檢測手段。

結題摘要

腫瘤的早期發現和早期治療是提高腫瘤患者生存率和生存質量的重要因素，尋找具有腫瘤特異性和敏感性的喉癌分子標誌物是早期發現腫瘤的重要手段。很多腫瘤中都發現線粒體DNA突變。線粒體DNA易於受到氧化損傷而突變增多，菸草是典型的DNA損傷劑，這種改變可能發生在腫瘤進展的早期。而喉癌的病因是大量吸菸。線粒體的D-loop區是線粒體基因的調控區，是線粒體DNA突變的高發位點。線粒體通過氧化磷酸化過程產生ATP為細胞供能，同時產生氧自由基（ROS）。慢性ROS接觸可以對線粒體DNA產生氧化損傷，導致線粒體功能障礙，反過來促使ROS增多，加重線粒體DNA損傷。 　　我們利用PCR為基礎的直接測序，篩查原發喉癌組織和對照正常咽喉黏膜的線粒體D-loop區的突變位點，找出與喉癌組織相關的線粒體突變位點，計算突變發生頻率和部位，分析突變特點。結果顯示，在原發喉癌組織中有高頻率的體細胞性突變和多態性變異，喉癌組織中有50.8%（31/61）突變，分布集中在HVR I和HVR II部位的59個核苷酸位點, 主要是鹼基的替換，絕大部分突變為同質性，只有5例為異質性突變。65.6%的喉癌患者發現多態性改變，線粒體轉錄因子結合位點D310區的303－309的C-tract區的不穩定發生率較高。同時，用線粒體去極化劑valinomycin處理三種喉癌細胞系和對照細胞系HL-60經過valinomycin處理後，用細胞膜電位探針JC-１染色和凋亡特異性探針annexinV染色，用流式細胞儀分別測量它們的線粒體膜電位和凋亡率。western印記用來檢測細胞漿內的細胞色素Ｃ的釋放。在經過24小時的處理後所有細胞均顯示完全的線粒體去極化，只有HL-60細胞出現凋亡和細胞色素Ｃ釋放，而喉癌細胞系沒有出現。另外我們利用EB處理喉癌細胞系，使之成為敲除線粒體的喉癌細胞系。人喉癌細胞系JHUo11在加入溴化乙錠（EB）的培養基中培養以去除線粒體DNA，經過四個月培養，PCR未擴增出線粒體DNA條帶，健那綠染色鑑定成功培養出獨有的喉癌ρ0細胞。總結研究結果我們發現喉癌的mtDNA D-loop是一個具有高頻突變率和高度多態性的不穩定區域，可能在喉癌的發生、發展過程中起作用，線粒體突變的檢測可能成為喉癌早期診斷的分子標準物。喉癌細胞系表現出線粒體凋亡途徑的缺陷，線粒體DNA突變及功能障礙可能是喉癌發生的原因之一。