《結腸癌MT1F基因表達缺失的功能作用及其分子機制研究》是依託上海交通大學，由彭志海擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：結腸癌MT1F基因表達缺失的功能作用及其分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：彭志海
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
課題組前期研究發現，結腸正常上皮-腺瘤-腺癌病變過程中，MT1F基因表達依次下調，雜合缺失不能完全解釋其失調原因；MT1F能抑制腸癌RKO細胞增殖，但該功能需進一步驗證，分子作用機制尚待探討。MT1F是MT1家族中結構最保守的基因。MT1能直接結合及抑制NFκB激活，抑制腫瘤生長與轉移，並受PI3K/Akt調控。由此推測，MT1F通過抑制NFκB發揮抑癌功能，當MT1F表達缺失，促進NFκB活化及結腸癌發生，該異常過程由PI3K/Akt調控，分析結腸癌可能存在PI3K/Akt-MT1F-NFκB信號途徑。為證實以上假設，本項目採用基因轉染調節結腸癌細胞MT1F水平，體外體內實驗觀察其功能；利用雙螢光素酶報告基因等技術，探討MT1F對NFκB活性和下游靶基因的影響，闡明其分子機制；反向阻斷PI3K/Akt，檢測MT1F表達，發現新的信號分子，為干預有效的信號環節或研發新型抗腫瘤藥物奠定基礎。
結題摘要
本課題前期綜合採用LCM和基因晶片，以及LongSAGE對散發性結腸癌進行轉錄組學研究，並藉助生物信息學方法選定位於染色體16q13.1的MT1F為待研結腸癌相關基因；首先我們擴大樣本採用Real-time PCR檢測發現82.5%結腸癌組織中MT1F mRNA表達水平明顯低於對應正常組織。免疫組化結果顯示在MT1F mRNA表達下調病例中，結腸癌組織MT蛋白表達低於對應正常組織。然後構建MT1F質粒載體，運用脂質體轉染的方法在結腸癌RKO細胞中進行MT1F過表達轉染,RKO-GFP-MT1F為實驗組，RKO-GFP為NC組，並用G418篩選穩轉細胞株。體外功能結果顯示，結腸癌RKO細胞外源性過表達MT1F後，細胞增殖速率明顯減緩；平板克隆和軟瓊脂克隆形成實驗表明轉染MT1F後的RKO細胞克隆形成數量均明顯少於親本細胞及空載體細胞；Transwell實驗表明外源性MT1F過表達能使RKO細胞體外遷移和侵襲的能力明顯降低；流式細胞技術檢測結果發現外源性MT1F過表達能促進結腸癌RKO細胞凋亡，但對細胞周期無明顯影響，結合DNA Ladder實驗證實MT1F抑制結腸癌細胞生長的功能是通過誘導細胞凋亡實現的。進一步體內裸鼠移植瘤模型結果顯示MT1F穩轉RKO細胞形成的腫瘤體積和重量均小於對照組，MT1F能抑制結腸癌RKO細胞的體內腫瘤生成。機制研究，我們首先運用MSP方法檢測結腸癌組織樣本，但未發現結腸癌組織存在MT1F過度甲基化現象；其次，我們將RKO-GFP-MT1F，RKO-GFP以及RKO親本細胞進行核漿分離後，運用western blot方法檢測P65和IκBα蛋白表達情況，未發現MT1F基因可以在結腸癌RKO細胞中調控NF-κB 。最後我們套用PI3K抑制劑Wortmannin以及Akt抑制劑LY294002顯性負性技術分別處理RKO-GFP-MT1F和RKO-GFP細胞，運用western blot技術檢測P65和IκBα蛋白表達情況，結果顯示PI3K/AKt對MT1F和NF-κB 均無影響。
