《結核分枝桿菌ESX-5分泌系統內PE/PPE蛋白免疫原性研究》是依託揚州大學，由孫林擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：結核分枝桿菌ESX-5分泌系統內PE/PPE蛋白免疫原性研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：孫林
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
PE/PPE蛋白是分枝桿菌獨有的一類蛋白家族，通常以操縱子或者基因簇的形式存在，其編碼基因大約占整個結核分枝桿菌基因組的10%。目前還不清楚PE/PPE蛋白的確切功能，但越來越多的研究顯示，PE/PPE蛋白與結核分枝桿菌的毒力、抗原變異以及在巨噬細胞內的生存密切相關。VII型分泌系統是近年來在結核分枝桿菌中發現的一種新型分泌系統，一共有5種類型，其中與毒力相關的為ESX-1和 ESX-5，目前的研究主要集中在ESX-1上，對ESX-5的研究還鮮有報導。在ESX-5內含有PPE25-PE19基因簇，前期實驗表明，該基因簇的缺失將導致結核分枝桿菌對小鼠的毒力大大降低。本項目以ESX-5內的PE/PPE蛋白為研究對象，採用原核表達策略對其進行表達並純化，以小鼠為動物模型來評價它們的免疫原性，並對具有細胞免疫原性的候選蛋白進一步鑑定出優勢T細胞表位，為開發結核病早期診斷試劑和新型疫苗提供理論基礎。
結題摘要
VII型分泌系統是在結核分枝桿菌中發現的一種新型分泌系統，一共有5種類型，其中與毒力相關的為ESX-1和ESX-5，目前的研究主要集中在ESX-1上，對ESX-5的研究還鮮有報導。在ESX-5內含有ppe25-pe19基因簇，該基因簇的缺失將導致結核分枝桿菌對小鼠的毒力大大降低。本項目對ESX-5內的PE/PPE蛋白的免疫生物學特性進行了研究。 通過大腸桿菌表達系統成功表達了PPE25、PPE26、PPE27和PE19蛋白，分子量分別為40 ku、44 ku、41 ku和15 ku。純化的PPE25、PPE27 和PE19蛋白對小鼠巨噬細胞RAW264.7的活性有顯著的抑制作用，且呈現劑量依賴性。 構建了表達ppe25、ppe27基因的重組恥垢分枝桿菌，與空載體對照菌相比，重組菌的生長曲線沒有發生明顯變化，但是在巨噬細胞RAW264.7內的生存能力去明顯增強。亞細胞定位結果顯示，PPE25和PPE27蛋白均表達於細胞的表面。 純化的重組蛋白能有效地刺激紐西蘭大白兔產生特異性抗體的產生，進一步實驗證實，PPE25/27: 56-71、PPE26: 370-385和PE19: 56-71 是相關蛋白的優勢B細胞表位。結核病人的外周血單核細胞經PPE25/PPE26/PPE27 蛋白混合物或者PE19 蛋白刺激後，均能引起抗原特異的IFN-γ、IL-2、TNF-α等細胞因子分泌，從而說明融合蛋白具有細胞免疫原性。通過表位作圖的方法共鑑定出PPE25: 236-255、PPE25: 281-295和PPE25: 321-335是ESX-5分泌系統相關PPE蛋白的特異表位；PE19: 1-18為ESX-5分泌系統相關PE蛋白的特異表位。通過SYFPEITHI軟體預測並進行實驗驗證，PPE25/27: 44-52和PPE26: 44-52是MHC-I T細胞表位。製備了針對PPE26: 44-52表位的CD8+ T細胞雜交瘤，共獲得1E1、4A8 和4D8三個克隆，且MHC限制性都為H-2Kd。 通過細菌雙雜交系統構建了ESX-5分泌系統內的蛋白相互作用網路，生物信息學分析發現Rv1787~Rv1792 這個區段不是ESX-5 分泌系統的核心組分。這些數據將有助於對結核分枝桿菌ESX-5 分泌機制的深入研究，為結核病的預防、診斷和治療提供理論依據。
