細胞層工程結合基因修飾再生顳下頜關節滑膜的研究

《細胞層工程結合基因修飾再生顳下頜關節滑膜的研究》是依託武漢大學，由龍星擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：細胞層工程結合基因修飾再生顳下頜關節滑膜的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：龍星
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

顳下頜關節紊亂病（Temporomandibular disorders，TMDs）是臨床上的常見病和多發病。TMDs會導致顳下頜關節滑膜不同程度的病理改變。當滑膜出現不可逆的病變時，關節的潤滑功能和營養功能被破壞，加重了顳下頜關節的退行性改建。目前尚無有效方法修復病損滑膜。利用多能幹細胞移植再生修復病變滑膜是一種有意義的嘗試。研究表明透明質酸合成酶2基因可以促進滑膜細胞高分子量透明質酸的合成，從而提高關節潤滑和營養功能。本項目研究顳下頜關節滑膜來源和骨髓來源的間充質幹細胞對滑膜再生的具體作用，通過慢病毒載體介導的透明質酸合成酶2基因對種子細胞進行修飾，利用先進的細胞層工程（Cell sheet engineering）技術體外構建滑膜樣組織。通過已建立的TMDs動物模型，植入體外構建的滑膜樣組織，探討此條件下顳下頜關節滑膜修復與再生的過程和機理，為今後TMDs的治療提供了新思路。

結題摘要

背景：顳下頜關節紊亂病（Temporomandibular disorder，TMD）是臨床上的常見病和多發病。當滑膜出現不可逆的病變時，關節的潤滑功能和營養功能被破壞，加重了顳下頜關節的退行性改建。本實驗利用組織工程修復滑膜，並通過基因轉導的方式製造出具有更強分泌透明質酸功能的滑膜細胞。 主要內容：1.研究體外不同HAS2表達水平的種子細胞構建的滑膜樣組織的生物學特性。從滑膜細胞中提取RNA並逆轉錄成cDNA，設計引物，成功得到人透明質酸合成酶2（HAS2）基因全長片段並將人HAS2基因插入質粒PET-28a，構建重組質粒。將重組質粒轉入大腸桿菌中，觀察重組蛋白的表達情況和活性。構建人工滑膜方面，利用滑膜中的主要細胞外基質成分一型膠原與滑膜細胞，通過層疊的方式製造出具有三層細胞結構的人工滑膜。 2.研究由種子細胞構建的滑膜樣組織與健康TMJ滑膜組織的生物學特性的差別。對三層結構的組織工程滑膜進行體外增殖檢測、透明質酸（HA）分泌量的檢測、掃描電鏡和透射電鏡觀察、透明質酸合成酶（HAS2）的檢測。 3.將構建的人工滑膜組織、一型膠原和脫細胞真皮植入裸鼠皮下，分析其植入體內的生物學特性。植入裸鼠皮下兩周，觀察三層結構的細胞層在模擬體內環境下的分泌功能和降解情況。 重要結果及關鍵數據：基因轉導方面，成功獲得人HAS2基因並構建了PET-28a-HAS2重組質粒和PET-28a-HAS2-EGFP重組質粒。構建EGFP-HAS2融合蛋白原核表達質粒。通過細胞表面標誌的鑑定，證實本實驗所用細胞為B型滑膜細胞。成功構建出具有三層滑膜細胞結構的細胞層，即人工滑膜。蘇木素伊紅染色和透射電鏡觀察，發現人工滑膜與天然滑膜在層次結構與形態上相似。在透射電鏡下觀察，發現人工滑膜與天然滑膜均不具備細胞連線器，如橋粒、半橋粒。體外功能檢測方面，發現三層結構的細胞層相比對照組具有更多的HA分泌量和HAS2的表達，並且細胞有在層狀的結構中增殖更快。裸鼠皮下移植實驗發現，人工滑膜能在體內環境存活2周，並且原有的一型膠原成分被宿主的成纖維細胞侵入並分泌膠原，並有血管的長入，使原有的人工滑膜在結構、成分上更像天然的滑膜組織。 科學意義：本實驗第一次通過組織工程技術構建細胞層模擬顳下頜關節滑膜組織，為治療顳下頜關節紊亂病提供了新的方法。