《細胞凋亡相關基因APAF1/CASP9與人類神經管畸形的相關性研究》是依託復旦大學，由周翔宇擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：細胞凋亡相關基因APAF1/CASP9與人類神經管畸形的相關性研究
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：周翔宇
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
細胞增殖和凋亡等過程的均衡是胚胎髮育期神經管正常閉合的基礎。我們套用二代靶向和全基因組測序技術分別對363例和100例神經管畸形(NTDs)患者進行篩查，發現細胞凋亡通路相關基因有大量突變。CASP9是凋亡的關鍵酶，APAF1是其激活因子，二者功能密切相關。我們在APAF1和CASP9基因中分別檢測到5個和4個NTD患者特有的突變位點(CASP9中有2個突變重複出現)，而在865例正常對照中均未出現。提示APAF1和CASP9基因突變與人類NTDs發生高度相關。已有報導APAF1和CASP9基因敲除小鼠均出現露腦和顱裂畸形，但在人群中的致病性目前尚無研究。本項目擬針對篩查出的9個突變，以小鼠神經前體細胞、人胚胎幹細胞和斑馬魚為模型，尋找APAF1 /CASP9基因變異導致人類神經管畸形發生的生物學證據，並闡明其致病機制，從而從細胞凋亡角度深化對NTD發生機制的理解。
結題摘要
神經管缺陷是常見的先天性疾病,由於胚胎髮生早期的神經管閉合失敗而導致。目前全球已經報導了超過250小鼠NTD致病基因的研究模型，這表明NTD病因的分子機制是複雜的。其中細胞凋亡途徑APAF1、CASP9和CASP3等基因敲除小鼠出現典型的NTD表型包括嚴重的顱面部畸形和無腦畸形。為了進一步探索人類NTDs的病因，我們對352例NTD患者和224例正常對照進行下一代捕獲目標測序，包括上述的3個凋亡相關基因。我們在三個凋亡相關基因CASP9、APAF1和CASP3檢測到14個非同義基因變異（蛋白質改變，等位基因頻率＜1%）。這些變體都是患者特有的， 224個正常對照均不攜帶以上突變。其中10個突變位點在1000G資料庫中沒有報導。後續的序列保守型分析表CASP9R180C（p.Arg180Cys），CASP3Q217H（Gln217His）和APAF1P335R（Pro335Arg）在不同物種和CASP其他家族中極為保守。值得注意的是，這三種變體，位於蛋白質結合位點，一致被五種軟體預測為有害突變，包括SIFT、Poly-phen2，Mutationtaster，Mutationtaster和Provean.接下來我們對這些候選突變進行了功能分析。之前文獻報導的CASP9 C287A（活性位點）和D315A（切割位點）作為陽性對照，我們發現CASP9突變特別是R180C完全破壞了CASP9和CASP9 K292E的自我切割，同時嚴重影響CasP3和PARP的自我切割。
有趣的是，CASP3 Q217H我們發現AKT的磷酸化（T308）和p37亞單位的釋放。蛋白質的後續分析使用酵母雙雜互動作用-系統顯示CASP9的共轉染（WT）和APAF1激活活性2.13倍。而CASP9（R180C）與APAF1共轉染未激活報告基因。在這項研究中，我們發現NTDs患者APAF1單基因LoF變異。雖然人類NTDs的病因是多因素的，我們的研究結果表明凋亡相關基因包括CASP9，APAF1和CASP3與中國漢族人群的神經管畸形的發生密切相關。
