《納豆激酶分子內分子伴侶與成熟肽斷裂的分子機理研究》是依託北京工商大學，由賈焱擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：納豆激酶分子內分子伴侶與成熟肽斷裂的分子機理研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：賈焱
- 依託單位：北京工商大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
納豆激酶（NK）是納豆發酵過程中產生的一種枯草桿菌蛋白酶，其全肽包括信號肽、前導肽和成熟肽。具有空間結構的成熟肽是NK的活性形式，它的形成必須有前導肽作為分子內分子伴侶（IMC）的協助。其中，IMC與成熟肽的斷裂是關鍵步驟。經典理論認為斷裂由成熟肽活性中心的S221作為親核催化劑完成。本人前期工作發現斷裂在S221C突變體中仍可發生，且在鹼性環境比在中性和酸性環境中的速率快，表明[OH-]而非S221是親核催化劑，因此提出了一個新的斷裂機理：環境中的[OH-]在活性中心的協同作用下，作為親核催化劑完成斷裂。本項目將測定不同pH環境中S221A突變體發生斷裂的動力學參數，利用計算機模擬、微量量熱技術測定不同pH環境中斷裂時的熱力學參數，並結合結構模型進一步證明[OH-]的作用；結合生物信息學和定點突變研究活性中心與IMC的相互作用，分析它們的協同作用。本項目的成功實施可修改或補充經典理論。
結題摘要
納豆激酶（NK）是納豆發酵過程中產生的一種枯草桿菌蛋白酶，其全肽包括信號肽、前導肽和成熟肽。具有空間結構的成熟肽是NK的活性形式，它的形成必須有前導肽作為分子內分子伴侶（IMC）的協助。其中，IMC與成熟肽的斷裂是關鍵步驟。經典理論認為斷裂由成熟肽活性中心的S221作為親核催化劑完成。課題組根據前期工作，提出了一個新的斷裂機理：環境中的[OH-]在活性中心的協同作用下，作為親核催化劑完成斷裂。本項目證明了此機理的正確性。課題組首先運用分子生物學技術，成功構建了活性中心突變體NK（S221A、S221C、D32A和H64A），通過體外摺疊的方式模擬NK的摺疊過程，分別得到了成熟肽的活性形式並將其純化。S221A和S221C突變體蛋白幾乎喪失了酶活性，D32A和H64A突變體蛋白的酶活性大幅下降，卻均可成功摺疊，初步證明了其IMC與成熟肽的斷裂並不符合經典理論，S221並非親核催化劑；其次，我們設定不同pH環境，分析四個突變體NK在pH梯度環境下的摺疊速率，發現隨著pH的升高，其摺疊速率也隨之升高，進一步說明S221並非IMC與成熟肽斷裂的親核催化劑，而[OH-]可能為此過程的親核催化劑；再次，我們進一步測定不同pH環境下四個突變體NK的摺疊速率，從動力學角度進一步證明[OH-]為親核催化劑的可能性；同時，我們運用生物信息學，構建並最佳化了IMC與成熟肽相互作用的結構模型，分析IMC與成熟肽的相互作用，發現其斷裂之處（Y77）與S221相距較遠（＞3.5Å），且與催化中心其他殘基D32、H64和N155也無直接相互作用，與斷裂殘基附近的胺基酸（I73、H75）則可形成氫鍵，提示活性中心參與了此斷裂過程。且分子生物學的結果表明，四個突變體NK的摺疊速率均緩於野生型NK，進一步證明課題組提出的IMC與成熟肽斷裂的分子機理的客觀存在性，即活性中心與IMC形成的相互作用通過協同作用，輔助[OH-]完成IMC與成熟肽的斷裂。此機理的論證表明了IMC與成熟肽斷裂的分子機理具有多樣性，豐富了蛋白質摺疊理論。同時，為提高NK的摺疊速率、增強NK的活性或抗氧化性，奠定理論基礎，具有套用價值和社會效益。
