糖基轉移酶高通量鑑定方法的完善與套用

《糖基轉移酶高通量鑑定方法的完善與套用》是依託南開大學，由王鵬擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：糖基轉移酶高通量鑑定方法的完善與套用
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王鵬
• 依託單位：南開大學

中文摘要

糖基轉移酶（GT）是合成糖類的主要酶類。糖類廣泛存在於所有物種中，並與其他三種生物大分子（蛋白/核酸/脂類）都具有直接或間接的關係，因此GT的鑑定對於了解各個生物過程都具有重要意義。GT數量龐大，目前已測序的基因組中有11萬餘個，然而已被鑑定的不過百餘種。主要原因是GT活性預測困難,且傳統的鑑定方法繁瑣複雜。我們結合基因快速克隆，蛋白體外表達以及高通量的檢測技術，首次實現了非標記的高通量GT的鑑定，該工作已被Nature Chemical Biology（2012,8,769）發表。本申請所述工作主要是對該技術的完善和實際套用。鏈黴菌屬是最高等放線菌，已知放線菌產生的抗生素90%為本屬產生。目前對該屬菌種糖類和GT的研究甚少，本申請將使用完善後的高通量鑑定技術對灰色鏈黴菌（鏈黴素工業生產菌種）中59個GT及基因進行鑑定，希望能夠對糖類的研究提供依據和基礎。

結題摘要

碳水化合物 (Carbohydrate)，包括寡糖、多糖以及糖綴合物廣泛存在於所有生命體中，並在諸多重要的生物學過程中發揮關鍵作用，包括細胞遷移和細胞因子作用、腫瘤發生及發展、病原微生物感染、免疫反應包括炎症和自身免疫病等。此外，糖蛋白糖鏈，還影響蛋白質的摺疊、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。許多糖類相關的生物學過程都是潛在的藥物治療靶點，碳水化物特別是糖綴合物的研究對於新藥研發具有重要意義，也因此日益被科學家和生物醫藥公司所重視。天然界中，參與糖綴合物、多糖生物合成的酶統稱糖基轉移酶。 之前，我們課題組融合了高通量基因克隆技術，無細胞蛋白表達技術，自組裝單層糖晶片技術以及線上質譜分析技術，建立了一種高通量的糖基轉移酶鑑定技術（Nature Chemical Biology. 2012, 8: 769-773）。課題實施過程中，我們進一步發展了該方法，並對一個物種或特定腫瘤細胞的N-糖基化蛋白在糖組學基礎上進行了抓取和鑑定（J.Am.Chem.Soc.2016,138:11473-11476）。此方法不依賴於傳統的糖結合蛋白（lectin），而是通過特定的糖基化修飾和點擊化學反應進行N-糖蛋白的抓捕，並通過質譜分析進行鑑定。相比於傳統的lectin親和篩選，新發表的方法具有更好的特異性，操作更為簡易，極大的提高了鑑定效率。同時我們也發展了O-GlcNAc修飾蛋白的基於組學的抓捕鑑定方法（ACS Chem. Biol. 2016, 11: 3002-3006）。 除了進一步擴充用於高通量糖基轉移酶鑑定的糖晶片糖供體（大於31種糖核苷酸）和受體（約30種寡糖以及超過20中糖肽/蛋白），我們同時發展了N-糖蛋白/多肽的體外（in vitro）酶法製備技術。並對N-蛋白糖基轉移酶進行了改造，擴充了其底物特異性（Chem. Commun.,2017, 53:9075-9077; J. Biol. Chem. 2017, 292: 8856-8863）。新的重要的糖基轉移酶以及重要突變體的篩選鑑定均得益於我們開發的高通量糖基轉移酶的鑑定方法。