《糖基轉移酶CgtB底物特異性改造及其機理研究》是依託上海交通大學，由張勇擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：糖基轉移酶CgtB底物特異性改造及其機理研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張勇
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
糖基轉移酶是酶法合成生物活性寡糖及糖基化合物的關鍵酶。但實際套用中，糖基轉移酶往往受到其活性較低，底物特異性和穩定性較差的局限，對這類酶的分子改造一直受到廣泛關注。CgtB是來自細菌的beta-1,3-半乳糖糖基轉移酶，在合成GM1類神經節苷脂和腫瘤相關T抗原上具有重要的套用前景。先前，我們使用超高通量的FACS篩選方法，成功將該酶催化活性提高了近300倍。然而由於CgtB對受體底物GalNAc特異性較差，生成大量副產物，限制了其廣泛套用。因此，本項目擬通過套用FACS篩選體系對不同螢光分子標記的底物分別創造正向及負向選擇壓力，實現大規模隨機突變庫的高通量篩選，從而獲得底物特異性改善的突變酶。在此基礎上，我們擬解析野生型和突變體CgtB的晶體結構，結合動力學數據揭示突變體性質變化的結構基礎，以促進對糖基轉移酶家族的催化機理和底物特異性識別機制深入理解，為酶分子改造提供科學依據。
結題摘要
糖基轉移酶是酶法合成生物活性寡糖及糖基化合物的關鍵酶。實際套用中，糖基轉移酶往往受到其活性較低，底物特異性和穩定性較差的局限。目前，針對來自細菌的 beta-1,3-半乳糖糖基轉移酶CgtB ，我們通過酶學方法合成了適用於糖基轉移酶的雙螢光底物，並利用該類底物創造正向及負向選擇壓力，使用FACS 篩選方法實現3.6×107的CgtB隨機突變庫的高通量篩選，將CgtB 針對受體底物 GalNAc 特異性相對野生型提高了約21倍，從而獲得底物GalNac特異性改善的突變酶。在此基礎上，我們利用特異性活性改善的CgtB酶突變體合成了神經節苷脂GM1一系列衍生物，開展了GM在哺乳動物們mTORC1信號通路和激活免疫系統參與抑制格蘭仕陽性細菌感染研究。研究中對酶分子穩定性，底物選擇性等催化機制進行結構研究，力圖為該家族酶分子改造和套用提供科學依據。
