《米多黴素合成的生化途徑與基因改造》是依託福建師範大學，由李力擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：米多黴素合成的生化途徑與基因改造
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：李力
- 依託單位：福建師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
米多黴素(即滅粉黴素)是一種具有強烈抑制植物白粉病活性的肽核苷類抗生素，在農業和園藝業上具有重要的套用價值。前期的工作克隆了與米多黴素生物合成起始相關的兩個重要基因，通過體內體外實驗揭示了它們的功能，並且實現了米多黴素生物合成基因簇的異源表達。本研究旨在通過生物信息學分析，基因敲除結合代謝產物分析，功能蛋白體外催化反應，以及同位素前體餵養實驗，以闡明米多黴素合成的完整生化途徑，揭示發生在這一具有特殊化學結構的抗生素生物合成途徑中的特異性生化反應過程；通過引入外源基因的手段，將米多黴素的生產菌株改造成專一生產高活性衍生物的工程菌株。為提高米多黴素的產量以及改造其結構提供分子基礎和套用基礎。
結題摘要
米多黴素（mildiomycin）是一種由生裂鏈輪絲菌（Streptoverticillum rimofaciens）產生的能夠強烈抑制植物白粉病的肽核苷類抗生素。本課題在克隆了米多黴素生物合成基因簇的基礎上，在變鉛青鏈黴菌1326中異源表達了米多黴素；通過基因敲除結合產物的HPLC-MS鑑定的方法確定了基因簇的邊界，將其限定在16個開放閱讀框中。對於一個可能的糖基轉移酶MilC進行了基因敲除，並在大腸桿菌中表達了具有活性的蛋白，體外酶活催化實驗證實了MilC的胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶的糖基轉移功能，並且對胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶都具有活性，這個米多黴素產物中的兩個組分相吻合；序列分析MilG顯示其含有CXXXCXXC的motif，為Radical SAM家族蛋白的典型特徵，基因敲除milG導致了在發酵液中羥甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的大量累積。C13標記的精氨酸餵養實驗表明其完整的6個碳原子摻入了米多黴素的生物合成，吡喃糖上在C5位上發生了脫羧反應，精氨酸的C2與其形成C-C鍵；同時，外源的C13標記的4-羥基-L-精氨酸不能參與米多黴素的生物合成表明米多黴素生物合成過程中精氨酸殘基的羥化發生在精氨酸骨架合成之後。通過系統的基因敲除實驗並結合殺稻瘟菌素的生物合成基因簇的比較研究，得到了較為完整的米多黴素生物合成途徑：胞嘧啶核苷單磷酸在MilA的作用下發生胞嘧啶C5位上的羥甲基化，然後水解酶MilB作用形成胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶，糖基轉移酶MilC作用於UDP-葡萄糖醛酸與胞嘧啶或羥甲基胞嘧啶，形成（羥甲基）胞嘧啶葡萄糖醛酸，在MilG作用下脫羧，並和L-精氨酸結合，經過一系列後修飾反應，最後和絲氨酸合成出最終產物-米多黴素。
