程式化多功能siRNA基因載體設計及作用機理研究

項目摘要

siRNA基因是一類新型的治療基因，其傳遞入胞並發揮功效是一個複雜的多步驟生物過程，高效載體的設計更是目前的研究熱點。已有的非病毒載基因系統中陽離子聚合物和陽離子脂質體在siRNA傳遞的各步中各具優勢，但仍不甚理想。本項目設計合成一類新型脂質聚合物，合理整合載體中各項功能，程式化的在siRNA傳遞過程中發揮作用。聚合物在胞外，以高密度的正電荷裝配基因，親水性PEG鏈禁止非特異性作用，靶向基團特異性識別誘導入胞，之後能程式化的去PEG，將脂質融合和質子泵等溶酶體破壞性能恢復，從而順利釋放基因發揮作用。載體設計考慮到從體外載體裝配、靶細胞識別、細胞吸附、內吞、載體分離、內吞體逃逸各個步驟，通過載體結構對比和螢光探針標記，更直觀全面的評價載體在各步中對siRNA傳遞的影響。通過篩選可得到穩定/高效/低毒的新型載體，為基因載體的設計提供有力的生物學研究基礎。

結題摘要

將治療性的基因傳遞入胞並發揮功效是一個複雜的多步驟生物過程，高效的載體設計是保證其有效發揮功能的重點。由於傳遞過程中的微環境不同，載體需要在不同時間和位置發揮不同的作用。為此，本項目設計合成了具有“程式化”去禁止特性、靶向性的多功能聚合物，對其安全性、體外轉染情況和體內作用效果進行評價。執行過程順利，按照原有計畫構建了pH敏感的脂質聚合物，在親脂性的膽固醇與親水性的PEG鍵引入腙鍵，並在禁止層上連線上靶向基團。此外，我們還構建了另一種高分子的陽離子聚合物，載體的禁止層設計引入還原敏感的二硫鍵。我們對兩種環境敏感系統的合成進行了最佳化，考察了敏感鍵的比例、PEG的密度等對環境回響速度和程度上的影響和規律；研究靶向基團濃度、密度對細胞識別的效能探究其進入細胞後的變化，探究不同系統對入胞過程、吞噬原理、胞內位置及轉染效果的相互關係；基於體外研究的成果，將最佳化的系統套用到動物體內，考察分析體內外結果的關聯性、靶向效率及體內分布，以期得到穩定、高效、低毒的新型載體，為基因載體的設計提供有力的生物學研究基礎。隨後，在“去禁止”化設計的複合載體成功的基礎上，我們又賦予了複合物核內陽離子聚合物（PEI）環境敏感的特性，希望核內複合物（PEI/DNA）能在循環時穩定存在，在進入細胞後解離，有效釋放DNA。通過我們的研究，已經得到三類“程式化”設計的環境回響型基因傳遞載體，對腫瘤細胞具有特異的識別性，其體外轉染效果較傳統載體分別高出40、14和5倍，體內效果提高一個數量級。經過對入胞過程和原理的研究，我們確定此類“程式化”的載體模擬了天然病毒的轉染步驟，其化學和物理特性隨微環境不同而發生變化，引起特定的生物學效應。項目通過三年的實施，圓滿完成了研究計畫，達到了預期目標，取得了一系列研究成果。共發表SCI源刊論文7篇（包括材料方面權威雜誌Advanced Materials 1篇，生物材料方向的權威雜誌biomaterials 3篇，journal of controlled release 1篇）；申請發明專利5項，1項獲得授權；培養了3名博士研究生2名碩士研究生。基於該項目的研究基礎和成果，項目負責人在執行期間又獲得了1項國家自然基金面上項目和1項四川大學優秀青年學者科研基金，獲得2010、2012和2013年“四川大學青骨幹教師”榮譽稱號；以第一主研參與了1項中德中心國家自然基

程式化多功能siRNA基因載體設計及作用機理研究

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