《磷脅迫下草酸青黴有機酸代謝的分子機制》是依託大連理工大學,由高曉蓉擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：磷脅迫下草酸青黴有機酸代謝的分子機制
- 依託單位：大連理工大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：高曉蓉
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
在磷酸鈣等難溶性無機磷源脅迫條件下，草酸青黴以產生大量有機酸而實現高效溶磷能力，但由於環境中碳、氮等因素能顯著影響產生的有機酸種類和數量，使得菌體溶磷能力發生較大變化，這也是嚴重製約溶磷微生物套用的共同瓶頸問題，探明磷脅迫下的有機酸代謝分子機制迫在眉睫。本項目基於已構建的磷酸鈣脅迫下的草酸青黴cDNA消減文庫，利用KEGG建立了該菌特有的磷脅迫代謝網路資料庫，發現了有機酸代謝相關路徑，擬進一步根據資料庫中的物質代謝網路圖重構有機酸代謝網路，從中確定與有機酸積累相關的關鍵差異表達基因，通過Real-time PCR對關鍵基因進行轉錄水平跟蹤，輔之以生物化學水平上的相應酶活性檢測和代謝產物水平上的有機酸定性定量分析，闡明磷脅迫下的功能基因表達回響在有機酸代謝過程中的分子作用機理，為深入了解草酸青黴的分子溶磷機制提供科學依據，對草酸青黴菌的規模化生產和套用具有重要意義。
結題摘要
構建了磷酸鈣脅迫下草酸青黴正、反向cDNA消減文庫；功能分類結果顯示EST序列主要與物質和能量代謝、物質轉運、細胞和機體防禦、轉錄翻譯表達調控、信號轉導等相關；基於KEGG有機酸代謝網路資料庫，確定磷脅迫回響的有機酸合成積累緊密相關的主要標誌物有線粒體蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烏頭酸水合酶、己糖激酶。 利用螢光定量PCR技術在分子水平上研究了兩個最關鍵基因線粒體蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶基因對磷脅迫的相應機制，結果表明草酸青黴菌可先通過提高線粒體蘋果酸脫氫酶的轉錄水平，直接增加草醯乙酸合成蘋果酸的能力，富馬酸酶基因的過量表達回響稍晚於蘋果酸脫氫酶基因；對應1-7天的磷脅迫下兩種關鍵酶活力的動態變化與各自的基因轉錄水平變化相一致，生化水平上驗證了mMDH基因和富馬酸酶基因的編碼蛋白對草酸青黴菌回響磷脅迫具有重要作用；通過HPLC技術監測發酵液中有機酸含量動態變化情況發現，草酸青黴菌在正常生長狀態下以分泌大量草酸為主要有機酸，但在低磷脅迫條件下卻極大的減少分泌量；原本產生的少量乙酸，在磷脅迫下分泌完全受到抑制，而正常生長僅產生極少量的蘋果酸卻在低磷脅迫時表現出極大量的快速增加， 蘋果酸的分泌量隨時間變化趨勢與關鍵基因的回響過程和對應的酶活性變化幾乎吻合，在生理水平上清楚的說明草酸青黴菌在磷脅迫下，受體內蘋果酸脫氫酶、富馬酸酶等的基因表達調控，改變了原有的有機酸代謝路徑，最終實現菌體對難溶磷的生物可利用性。 重構了利於蘋果酸積累和分泌的代謝網路：草酸青黴由於某種原因關閉了乙醛酸代謝路徑，減少的琥珀酸不利於三羧酸循環的推動。為了獲得基本的生存能量，線粒體蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶回響表達，催化草醯乙酸和富馬酸合成蘋果酸。因為三羧酸循環中間代謝產物蘋果酸的雙重作用（填補反應）是生成葡萄糖，過量的蘋果酸在驅動TCA循環產能的同時，穿梭到線粒體膜外，在蘋果酸脫氫酶的作用下合成草醯乙酸，為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶提供催化底物進行糖異生，用於合成真菌細胞壁構成的多糖及其它物質轉換，以抵抗逆境環境。同時，順烏頭酸酶協助檸檬酸向異檸檬酸轉化，從而推動TCA循環。
