《研究尼古丁對小鼠精子mRNA及非編碼RNA的影響》是依託上海交通大學，由徐汪節擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：研究尼古丁對小鼠精子mRNA及非編碼RNA的影響
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：徐汪節
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
精子中存在一群複雜的RNA群體，這些RNA是否會受外界環境因素的影響而發生改變，這種改變是否會對生殖和胚胎早期發育發揮作用令人關注。為了更全面的解讀這一特有的RNA群體，我們擬採用SAGE方法，構建尼古丁處理前後小鼠精子的RNA的SAGE資料庫。分析這兩個SAGE庫中RNA標籤的種類和豐度的差異。對有差異的mRNA標籤進行功能分析；對未知標籤則採用rSAGE、RT-PCR、RACE等方法，獲得這些未知標籤的mRNA的全長，以及期待能夠發現新的基因，包括非編碼調控基因。再結合生物信息學，Norther-blot、原位雜交等方法，分析這些未知基因的功能，探討尼古丁對精子RNA群種類和豐度的影響，以及在不同組織中的差異表達情況。最後再運用反義RNA等方法，探討這些基因在胚胎髮育過程中的作用，從而解釋吸菸影響精子中發育、影響胚胎髮育的分子機制，進而探究RNA分子的表觀遺傳學的機理。
結題摘要
已有報導吸菸對人的生殖和胚胎髮育過程產生不良影響，但其分子機理不清楚。由於精子中存在一群複雜且穩定的RNA群體，我們擬從研究熱點且未知的精子RNA譜角度來分析這些RNA是否會受外界環境因素（香菸煙霧）影響而發生改變，以及這種改變是否與生殖和胚胎早期發育有關聯。為此首先我們建立了小鼠尼古丁模型，並分析了尼古丁處理前後小鼠精液質量，子代出生率及睪丸組織切片的形態學分析；其次採用RNA Seq高通量測序方法對兩組小鼠精子細胞進行深度測序，構建尼古丁處理前後小鼠精子的RNA譜資料庫。先利用生物信息學方法對表達譜整體性分析，然後結合RealTime-PCR法驗證並確定出差異較大且高豐度的RNA群進行後續的功能聚類及Pathway等方面分析；最後，選擇功能聚類中與精子發生、成熟及胚胎早期發育相關的RNA組分用實驗方法進行後續功能分析。已有結果表明：1、小鼠尼古丁處理5周模型結果分析，尼古丁處理後小鼠精子數量，形態變化及運動的變化，顯示精液質量有所下降，小鼠子代的出生率，存活率較低，以及睪丸組織中生精小管管壁變得疏鬆，生精上皮脫落、變薄；2、RNA Seq 測序獲得兩庫中原始RNA標籤近3萬種RNA（正常組33727種和尼古丁處理組29595種）。總RNA譜中，絕大數是mRNA占（85%），餘下是非編RNA；3、RealTime-PCR驗證並剔除測序中一些低豐度背景噪音，篩選出尼古丁處理前後高表達且差異較大（≥1.5倍）mRNA 6439種。對這群RNA進行生物信息學功能聚類及pathway等分析，歸納出受尼古丁處理影響且與精子發生、成熟及胚胎早期發育直接有關的RNA 11種；4、選定11種直接相關的RNA中高表達的5個基因在mRNA及蛋白水平上進行組織表達特異性分析，發現其中一個基因特異性表達於睪丸組織。對其免疫組化及電鏡分析，發現該基因特異性定位於精子發生過程中減數分裂及頂體形成過程中，其蛋白特異性表達與精子的頂體部位。免疫沉澱結果顯示，該蛋白與cadherin相關作用，後續的Knockout小鼠正在構建。初步結論：尼古丁處理後，小鼠精液質量及子代出生率和存活率均出現下降，睪丸組織發生鬆散性病變。可能的分子機制是，尼古丁影響精子發生、成熟等過程的基因表達調控，尤其是頂體形成及功能有關，該影響體現在精子中RNA譜特徵發生變化。詳細機制需要後續實研究證實。
