真菌黑色素生物合成新途徑的表達調控研究

《真菌黑色素生物合成新途徑的表達調控研究》是依託江蘇師範大學，由鄭維發擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：真菌黑色素生物合成新途徑的表達調控研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：鄭維發
• 依託單位：江蘇師範大學

項目摘要

黑色素生物合成是病原真菌抵禦環境脅迫的重要生存策略。真菌通過1,8-二羥基萘酚和多巴胺途徑合成黑色素，但樺褐孔菌水溶性黑色素合成不受這兩個途徑的專化性抑制劑熊果苷或三環唑抑制。前期研究發現樺褐孔菌一雜合的非核糖體肽合成酶-聚酮合酶基因(nrps-pks)表達產物與其水溶性黑色素相似，且該nrps-pks與蛋白激酶、二肽酶及溶血素共調蛋白等10個基因形成基因簇，但尚無該類黑色素合成途徑及生物學研究的信息資料。本項目擬以構巢麴黴遺傳操作體系，系統開展以下研究：(1) 藉助基因敲除技術分析nrps-pks結構域、產物組成單元及化學結構；(2)採用基因簇克隆技術探明nrps-pks基因簇激活機制；(3)利用原核表達技術闡明nrps-pks表達產物結構修飾，界定該類真菌黑色素合成的新途徑，從分子水平揭示真菌黑色素合成新途徑的表達調控機制，為真菌抵禦環境脅迫的生存策略提供新的理論依據。

結題摘要

樺褐孔菌是一種分布於高緯度寒冷地區的藥用擔子真菌，該真菌產生的水溶性黑色素能明顯改善胰島素的敏感性、降低血脂、清除自由基以及抑制腫瘤細胞增殖的藥理學活性。深層發酵培養條件下，樺褐孔菌在培養的對數後期可產生水溶性黑色素。然而，其生物合成途徑和表達調控機制尚不清楚。我們在樺褐孔菌基因組注釋的過程中發現一編碼非核糖體肽-聚酮合成雜合酶(NRPS-PKS)基因。該基因克隆到構巢麴黴wA位點後轉化子菌絲體有深褐色色素的積累。基因預測簇分析表明，編碼NRPS-PKS基因與產物結構修飾、轉運等10個基因組成一個基因簇。由於樺褐孔菌沒有遺傳操作體系, 無法闡明該基因簇與樺褐孔菌水溶性黑色素合成的關係。為此，我們將NRPS-PKS基因簇克隆到模式絲狀真菌構巢麴黴的wA位點，觀察NRPS-PKS基因簇在異源宿主中的表達及其代謝產物的積累研究。本項目實施期間取得以下成果：(1) 發現了樺褐孔菌參與水溶性黑色素合成的基因簇，該基因簇有10個基因組成，其中參與產物合成的基因有編碼非核糖體肽-聚酮合成雜合酶和二肽酶基因；參與產物轉運的基因有溶血素共調蛋白類似蛋白；該基因簇還含有與編碼介導病原菌與宿主蛋白相互作用的蛋白激酶基因、tRNA異戊烯基轉移酶基因以及與細胞活性相關的ATP酶家族ATPA基因。此外，還含有編碼磷酸二酯類酶基因、葡萄糖磷酸變位酶類似蛋白基因以及S-腺苷甲硫氨，酸依賴性的甲基化酶基因(SAM-DMT)。(2) 構建了NRPS-PKS基因簇的構巢麴黴轉化子，確定了該基因簇的產物結構為3,6-二羥基苯並芘酮酸。發現了樺褐孔菌黑色素生物合成，NRP-PK途徑。確定了產物結構為一異亮氨酸與3,6-二羥基苯並芘酮形成的肽類化合物。(3) NRPS-PKS和二肽酶基因的表達受SAM-DMT基因的調控；(4) 參與產物轉運的溶血素共調蛋白類似蛋白基因的表達受蛋白激酶基因調控。(5) 基因簇的初始產物在二肽酶的作用下，脂溶性的異亮氨酸被水解，產物的水溶性增加，轉運到細胞外在氧化酶的作用下形成水溶性黑色素。(6) 異源表達了具有活性的二肽酶。