瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病的相關性分析

《瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病的相關性分析》是依託吉林大學，由陳啟軍擔任項目負責人的重點項目。

基本介紹

• 中文名：瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病的相關性分析
• 項目類別：重點項目
• 項目負責人：陳啟軍
• 依託單位：吉林大學

項目摘要

免疫細胞（巨噬細胞、嗜中性粒細胞等）在病原生物感染的部位聚集和釋放免疫相關因子（淋巴因子、蛋白質水解酶、DNA網等）是機體抵抗病原感染的先天性免疫反應。惡性瘧原蟲感染人體後，寄生的紅細胞在後毛細血管區大量聚集，阻礙血液循環，造成組織功能障礙。然而，在蟲體聚集的部位很少有免疫細胞浸潤和明顯的炎症反應。很明顯，瘧原蟲具有拮抗宿主免疫系統的清除作用。瘧原蟲分泌的TatD-like DNase分子很可能是蟲體拮抗宿主免疫清除作用的關鍵分子。本研究將對感染人的瘧原蟲的TatD-like DNase的功能進行系統研究，首先分析TatD-like DNase在各種瘧原蟲中的表達規律、對宿主DNA的降解作用和對感染宿主免疫細胞的激活或抑制作用。最後通過基因敲除的方法，以感染鼠的伯氏瘧原蟲為模型，比較基因敲除前後的蟲體的致病力變化。進而確定該蛋白質的表達與蟲體致病力之間的的關係和瘧原蟲的致病機理。

結題摘要

瘧原蟲對宿主的危害主要發生在血液期，即蟲體在宿主紅細胞內的發育繁殖過程。多年來對瘧原蟲的生物學及致病機理的解析一直存在著很多空白。本研究通過生物信息學分析首先預測發現瘧原蟲能降解宿主免疫細胞胞外陷阱ETs (Extracellular Traps)結構的TatD-like DNase。瘧原蟲的TatD-like DNAse是一種非金屬依賴性的脫氧核糖核酸酶，其序列在不同瘧原蟲中非常保守，並且在N端存在一個20個胺基酸左右的信號肽。進一步對PfTatD在瘧原蟲紅內期的轉錄表達分析表明，PfTatD在瘧原蟲紅內期全程轉錄表達，並且在32小時達到轉錄高峰。間接免疫螢光和免疫電鏡研究結果與生物信息學預測相符，該蛋白質存在於納蟲溶泡膜與染蟲紅細胞膜之間，並且具有向外分泌的趨勢。在鼠瘧原蟲相關實驗中，發現TatD的轉錄與表達和蟲體的毒力成正相關，這也說明了該蛋白質在蟲體致病中的作用。進一步採用double crossover的方法敲除了P.berghei ANKA株編碼PbTatD的基因。對缺陷蟲株的毒力分析結果顯示，缺陷表達蟲株的感染能力和致死性都明顯下降。而將缺陷表達蟲株與巨噬細胞J774A.1體外共培養，發現該蟲株可以誘導巨噬細胞產生ETs結構，並且產生的數量明顯高於野生型蟲株。說明瘧原蟲TatD參與了蟲體逃避宿主ETs清除的過程。而在酶活性實驗中，重組TatD蛋白質能夠降解宿主DNA，這也進一步驗證了TatD參與蟲體致病性逃避宿主清除機理的假說，即蟲體將TatD蛋白質釋放到胞外，通過其脫氧核糖核酸酶的活性降解宿主產生的ETs結構中的DNA骨架來逃避其殺傷性作用。通過對小鼠免疫重組PbTatD和PcTatD蛋白質評價該蛋白質的免疫保護性。結果顯示免疫組的染蟲率要低於空白組和陰性組，並且小鼠的存活時間更長。而血清治療實驗的結果也與免疫保護試驗的結果相符。以上結果顯示，該蛋白質作為一個蟲體致病相關蛋白質，參與了蟲體逃避宿主天然免疫的過程，並且具有作為紅內期疫苗的候選抗原的潛力。本研究首次揭示了TatD-like DNase蛋白質作為瘧原蟲致病相關蛋白質，參與蟲體逃避NETs清除的過程，這對深入理解瘧原蟲逃避宿主天然免疫具有重要的意義，也為研製瘧疾疫苗提供了新的思路。