《番茄果實成熟相關Dicer-like 2c的調控機制研究》是依託中國農業大學，由朱鴻亮擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：番茄果實成熟相關Dicer-like 2c的調控機制研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：朱鴻亮
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
針對每年國內外果品采後損失嚴重的實際問題，開展果實成熟衰老機制研究具有重要的理論和實際意義。番茄是重要的園藝作物和研究果實成熟的模式植物，課題組前期研究表明small RNA合成中重要核酸酶SlDCL2c的表達與番茄果實成熟相關。本項目擬對SlDCL2c開展深入研究，通過轉基因、RNA-seq和Small RNA-seq等技術，解析SlDCL2c在番茄果實成熟中的生物功能及作用途徑；利用瞬時表達、Co-IP和體外重建等手段，在生化水平上探明SlDCL2c識別和加工果實成熟相關small RNA前體的生物學規律；最終準確而清晰的詮釋SlDCL2c調控果實成熟的分子機制，為果實發育成熟調控提供新的基因資源，為改造番茄果實性狀提供新的途徑。
結題摘要
小RNA在RNA沉默中扮演不可或缺的作用，它們的生成需要藉助Dicer蛋白的加工。Dicer是一種核酸內切酶，在植物中被稱作Dicer-like（DCL）。番茄中有四類DCL蛋白：DCL1-DCL4，其中DCL1、DCL3與DCL4的研究較為透徹。DCL2有四個成員：DCL2a、2b、2c與2d，DCL2b在番茄不同組織中表達含量最高。本項目在前期研究的基礎上，利用轉錄組學、分子生物學技術及生化技術研究DCL2b在抵抗番茄花葉病毒中的功能。主要結果如下： 利用cDNA末端快速擴增技術得到了包括非翻譯區在內的DCL2b基因全長，為其功能的研究奠定了基礎。在野生型番茄的葉、花及不同發育時期的果實中，利用實時定量PCR技術對 DCL2b進行表達含量分析。結果表明，DCL2b在不同組織與果實不同時期的表達差異較大，在綠熟期果實中含量最高。 對DCL2b進行組織定位實驗，結果顯示，DCL2b在番茄不同組織中均有高表達。亞細胞定位結果顯示DCL2b主要在細胞質表達，但活性不高。 利用CRISPR/Cas9技術得到番茄dcl2b突變體，通過small RNA-seq進行病毒檢測以及病毒接種實驗驗證可知，dcl2b受到番茄花葉病毒侵染後，出現明顯的病毒症狀。對染病及未染病的dcl2b進行small RNA-seq分析後發現，染病後，很多22nt的micro RNA（miRNA）含量降低，這些miRNA可以作為次級小干擾RNA（sec-siRNA）生成的觸發器，它們含量的降低使得許多抗病毒相關基因的sec-siRNA生成明顯下降。對野生型植株和dcl2b突變體進行轉錄組測序分析，結果顯示在染病後，dcl2b中脂肪酸代謝相關基因表達降低，鑒於病毒的複製需要宿主脂質的參與，這些基因含量的降低可能是植物想要降低病毒在體內的複製水平。 在染病和未染病的dcl2b中，22nt的miR6026均明顯降低。其前體結構與大部分miRNA前體相比，更接近於雙鏈RNA而非“莖環結構”的單鏈RNA。為檢測miR6026是否為DCL2b的剪下產物，在菸草中超表達DCL2b蛋白並利用兩步法對其進行純化，體外轉錄得到miR6026前體後，進行體外剪下實驗，陽性對照得到了目的產物但DCL2b並未對miR6026前體進行剪下，猜測DCL2b需要互作蛋白來行使剪下功能。
