畢赤酵母細胞壁蛋白質組分析及其甲醇脅迫回響機制

《畢赤酵母細胞壁蛋白質組分析及其甲醇脅迫回響機制》是依託華南理工大學，由林影擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：畢赤酵母細胞壁蛋白質組分析及其甲醇脅迫回響機制
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：林影
• 依託單位：華南理工大學

項目摘要

儘管甲醇酵母可以利用甲醇作為唯一碳源進行呼吸代謝、生物合成及能量利用，但仍然存在高濃度甲醇對細胞毒害和生長限速等問題。本研究以巴斯德畢赤酵母（甲醇酵母）為研究對象，在我們前期對巴斯德畢赤酵母轉錄組及GPI壁蛋白分析的基礎上，提出甲醇脅迫作用可能引起細胞壁蛋白發生重組和互補效應的假說，研究通過改進的同位素和生物素雙重標記的細胞壁蛋白樣品製備方法，利用2D LC-MS/MS的蛋白質組學分析手段，對甲醇脅迫作用的巴斯德畢赤酵母細胞壁蛋白質組進行分析，研究其細胞壁蛋白質組對甲醇脅迫回響的規律，開展差異細胞壁蛋白對細胞環境敏感性、甲醇耐性、細胞滲漏性等影響及其功能特性研究，進一步論證細胞壁蛋白重組和互補效應對甲醇脅迫回響的假說。研究不但為巴斯德畢赤酵母對甲醇脅迫及耐性機制研究提供理論依據，而且為構建巴斯德畢赤酵母外源表達超級分泌體系和高效酵母展示體系的構建提供可能。

結題摘要

儘管甲醇酵母可以利用甲醇作為唯一碳源進行呼吸代謝、生物合成及能量利用，但仍然存在高濃度甲醇對細胞毒害和生長限速等問題。本研究以畢赤酵母（甲醇酵母）為研究對象，研究從畢赤酵母中預測到了50個潛在的GPI型蛋白，然後以這50個蛋白作為錨定蛋白構建相應的表面展示體系，通過流式細胞術和Western Blot的分析確證了13個GPI型細胞壁蛋白。利用Cre/loxP系統建立畢赤酵母中基因敲除方法，驗證了畢赤酵母基因組數據預測得到的50個GPI型細胞壁蛋白中有45個蛋白被認為是非必需的細胞壁蛋白，在這些基因缺陷時細胞在正常條件下仍然可以正常生長，但大部分細胞壁蛋白的缺陷株引起細胞壁多糖的改構，其中gcw13、 gcw17、 gcw19、 gcw21和gcw22的缺陷使甲醇酵母細胞的甲醇耐性大幅度提高，初步的研究表明gcw17和 gcw19的缺陷株對EGFP的分泌表達有促進作用，為構建巴斯德畢赤酵母外源表達“超級”分泌體系和高效酵母展示體系的構建提供了基礎。研究並開展細胞壁蛋白缺陷株對螢光增白劑CW、 SDS和藤黃節桿菌酶等敏感性開展了研究，發現細胞壁通過改變細胞壁多糖的含量來增加對環境的抗性。 研究對畢赤酵母細胞壁蛋白表達量高的GCW14基因敲除，及對基因敲出缺陷株進行細胞生長、外源蛋白分泌表達、細胞壁多糖及細胞壁蛋白表達分析進行研究，發現無論是以葡萄糖還是以甘油或者甲醇為碳源，缺陷菌株GS115/ΔGCW14與對照菌GS115相比生長較差，說明GCW14基因雖然不是畢赤酵母生長的必需基因，但對畢赤酵母的生長造成一定的抑制。以該細胞壁缺陷株為基礎建立iTRAQ畢赤酵母細胞壁蛋白組的分析方法。為了提升細胞壁蛋白的捕捉量採取了細胞破碎、碎片收集及SDS蛋白抽提的方法，結果發現3623被分析蛋白中包含了過多的細胞內代謝途徑蛋白，可能影響了低豐度細胞壁蛋白的分析。近年來發展的活細胞直接酶切法製備細胞壁蛋白質組樣品的方法將為進一步論證細胞壁蛋白重組和互補效應以及畢赤酵母對甲醇脅迫及耐性機制研究提供基礎。由此研究路線由原計畫的由基因型（蛋白質組為功能基因組的範疇）到表型調整到表型到基因型的技術路線。 研究以發表論文4篇，其中SCI論文2篇。待發表論文2篇；申請並獲授權國家發明專利3項。