用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》是廣西大學和廣西南寧奧立高食品生化有限公司於2001年8月12日申請的專利，該專利的申請號為011283459，公布號為CN1335402，授權公布日為2002年2月13日，發明人是魏遠安、謝慶武、姚評佳、董毅宏、梁錦添。

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》闡述了一種以蔗糖為原料，工業化生產蔗果低聚糖（低聚果糖）方法，它包括固定化果糖基轉移酶製劑的工業化生產以及利用該酶製劑進行工業化生產FOS兩部分：一、選擇具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌株，在合適的培養基中培養，然後將培養得到的大量菌絲體進行破壁，用離心法和超濾法將酶分離純化，再用試劑將酶固定下來；二、分批反應法或柱式反應法以固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖；採用該發明方法得到的蔗果低聚糖產品不必經過活性碳脫色，不需離子交換柱脫鹽，可以獲得Brix≥75，固形物中總低聚糖≥50%的FOS糖漿，生產工藝簡化，操作便利，成本明顯下降。

2016年12月7日，《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》獲得第十八屆中國專利優秀獎。

基本介紹

中文名：用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法
公布號：CN1335402
授權日：2002年2月13日
申請號：011283459
申請日：2001年8月12日
申請人：廣西大學、廣西南寧奧立高食品生化有限公司
地址：廣西壯族自治區南寧市西鄉塘路10號
發明人：魏遠安、謝慶武、姚評佳、董毅宏、梁錦添
Int.Cl.：C12P19/14、C12P19/00、C12N11/00、C12N9/10、//(C12P19/14,C12R1:66)
代理機構：廣西南寧公平專利事務所有限責任公司
代理人：來光業
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

蔗果低聚糖（fructo oligo saccharide，FOS），又稱低聚果糖，是由1～3個果糖基通過β（2→1）糖苷鍵與蔗糖（用符號G-F表示）中的果糖基（用符號F表示）結合而生成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）等一類的碳水化合物。FOS由於其具有優異的生理學功能如促進腸內雙歧桿菌的生長、預防蛀牙等而普遍地被用作為保健食品配料使用。FOS存在於洋蔥、香蕉等許多天然植物中，但含量很低。商品化的FOS首先被H.Hidaka於1988年用酶法生產開發成功，他從研究黑麴黴的果糖基轉移酶開始，然後成功地套用於工業化生產FOS糖漿。果糖基轉移酶（fructosyltransferase，FTase），酶分類號為[EC、2、4、1、9]，能催化蔗糖（G-F）生成蔗果低聚糖，其酶促反應機理可用下式表示。

上式中：G-F--蔗糖，G-葡萄糖，FTase-果糖基轉移酶，GF2--蔗果三糖，GF3--蔗果四糖，GF4-蔗果五糖。

截至2001年8月，中國國內工業化生產FOS的2001年8月之前技術只有液體深層發酵法，即用液體深層發酵法培養黑麴黴，這種微生物能分泌果糖基轉移酶，從培養液分離收集黑麴黴菌絲體後，不經任何處理，直接投入蔗糖溶液中，使其轉化為FOS。該法的缺點是產酶菌絲體只能利用一次，在FOS生產過程中，由於菌絲體及其培養基成分的存在並參與反應，使產品色度及鹽份過高，需要活性碳脫色和離子交換塔脫鹽等後處理工序，使整個工藝繁雜，成本提高。至於菌體細胞的代謝物就只能作為雜質留在FOS產品中，無法除去，影晌產品質量。

中國專利96106345.9公開了一種低聚果糖的製備方法，它包括採用能產生果糖基轉移酶的菌種Aspergillus niger，將此微生物培養後，收集活性菌絲體，加入蔗糖溶液，於40℃-60℃接觸反應20-40小時，然後經活性碳脫色，用陰陽離子交換樹脂脫鹽，再過濾、濃縮、消毒、包裝，得到產品。但該專利所採用的方法也屬於液體深層發酵法，它是將培養產物包括菌絲體和培養基、培養基中的無機鹽一起投入反應罐中，產酶菌絲體也只能利用一次，得到的產品色度大，含鹽分高，需要加入活性碳脫色和經過陰離子樹脂和陽離子樹脂脫鹽，工藝過程複雜，生產成本也較高。

此外，雖有其他方法生產FOS的報導，如固定化細胞法，共固定化生產高含量的FOS研究等，但截至2001年8月仍停留在實驗室研究和試驗階段，未能用於中國工業化生產。其中固定化細胞法，即用海藻酸鈣凝膠將產酶菌體包埋起來的方法，與《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》的方法不同，日本已產業化，該法不足之處是對生產環境和條件要求苛刻（例如空氣淨化），而且細胞代謝物殘留在產品中的問題仍未能解決。至於共固定化法，指的是將葡萄糖氧化酶或葡萄糖異構酶與菌體細胞共固定化，條件更複雜，難以控制，中國國內外學者對此尚有爭議，而且截至2001年8月未能實現產業化。

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》發明人在實驗室研究了固定化酶法合成蔗果低聚糖的方法，在《食品與發酵工業》1995年第四期提出了用殼聚糖為載體和以戊二醛為固定化試劑，使果糖基轉移酶固定化，可多次使用，得到的蔗果低聚糖為透明的亮黃色，清香，蔗糖轉化率達90％左右，開創了固定化酶法合成蔗果低聚糖的新路。但由於某種原因，當時該方法還沒有套用於工業化生產。

發明內容

專利目的

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》發明人經過幾年的實驗室研究和工業化實驗，找到了一種固定化果糖基轉移酶酶製劑的工業化生產方法，以及利用該酶製劑以蔗糖為原料進行工業化生產蔗果低聚糖（糖漿或乾粉）的方法，該方法技術先進，工藝簡單，操作便利，生產成本低。

技術方案

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》的內容包括固定化果糖基轉移酶製劑的製備以及利用該酶製劑進行工業化生產蔗果低聚糖的兩部分，其工藝過程如下：

1、菌株培養和固定化酶的製備

選擇具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌株，在合適的培養基中培養，然後將培養得到的大量菌絲體進行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，再用固定化試劑將酶固定下來。

上面所述的具有能分泌果糖基轉移酶的優良菌株經《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》發明人進行實驗和篩選，有以下幾種可達到要求，它們是：米麴黴（Aspergillus oryzae）、黑麴黴（Aspergillus niger）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、海棗麴黴（Aspergillus phoenicis）和短梗帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）。

上面所述的合適的培養基包括以下幾種物質：1～10％蔗糖，1～5％酵母提取物，0.1～0.3％NaNO₃或者MgSO₄，1～5％玉米粉，其培養方法是在25～36℃，通氣量200～600毫升/分鐘，攪拌速度50～200轉每分條件下，經過20～60小時，獲得大量菌絲體。

上面得到的菌絲體必須先進行破壁，收集這些菌體細胞的胞內酶，才獲得較好的果糖基轉移酶，所述的菌體破壁可用已知的方法，如機械破壁法，凍融法，超音波破碎法，溶菌酶法等獲得果糖基轉移酶的粗酶，再用離心法和超濾法等將酶分離純化和濃縮。

上面所述的用試劑將酶固定下來的方法採用化學偶聯法，用來固定酶的載體是天然有機高聚物，如交聯瓊脂糖凝膠，一定交聯度的葡聚糖凝膠，殼聚糖凝膠等；所用交聯劑為戊二醛，利用戊二醛分子兩端的醛基分別與載體及酶分子上的NH₂基形成希夫鹼，可將酶分子和載體以五碳橋的形式連線起來，達到利用化學健來固定果糖基轉移酶的目的。所用戊二醛濃度在0.05～0.3％，過低或過高都影響固定化效果。

固定化過程中，酶和載體的比例範圍是每克載體需酶20～160u，當酶的用量＜20u/g載體時，固定化酶的酶活太低，酶促作用很難發揮出來，但當酶活＞160u/g載體時，酶的固定化效率太低，部分呈游離酶狀態，使用一次後就流失掉。

固定化的條件是：pH4～9，溫度10～60℃，攪拌速度20～100轉每分，交聯劑戊二醛濃度為0.05～0.3％。

固定化操作：果糖基轉移酶酶液經純化，濃縮後，用高效液相色譜法（HPLC）測定其酶活力，按一定的酶/載體比例，加入載體凝膠，混合，加入一定濃度的戊二醛溶液和少量CaCl，溶液，在上述條件下，交聯反應4～12小時，充分洗滌，離心甩乾，再成型和整型，可得固定化果糖基轉移酶，於0～5℃保存。

2、以固定化果糖基轉移酶法生產蔗果低聚糖（fructooligosaccharide，FOS）：

固定化果糖基轉移酶法生產FOS過程可以採用以下兩者之一：分批反應法或柱式反應法。

（1）分批反應法：在反應罐中，加入22～65％（w/w）的蔗糖溶液，按每千克蔗糖（乾）加入1000～4000U固定化果糖基轉移酶的酶量，控制反應液在pH4.8～7.8，溫度在32～55℃，攪拌速度在50～200轉每分的條件下，反應12～48小時調節固定化酶的數量、反應液溫度和時間，可以獲得合乎要求的FOS產品。反應完成後，用篩網過濾反應液，可以分離回收固定化酶，用於下一批原料的生產。

（2）柱式反應法：將固定化酶裝入柱中，以22～68％（w/w）的蔗糖溶液在pH4.8～7.8，溫度32～55℃下通過此柱，調節固定化酶的活性和數量，蔗糖溶液的流量、溫度等，可以控制FOS成分達到質量標準的要求。

改善效果

《用固定化果糖基轉移酶生產蔗果低聚糖的方法》的優點是技術先進，果糖基轉移酶經過固定化後，可以提高其利用率，採用分批反應法時，可以反覆使用70次以上。柱式反應法，每公斤酶可以生產白利糖度（Brix）≥50的FOS糖漿1000千克以上，而且FOS產品不必經過活性碳脫色，不需離子交換柱脫鹽，經濃縮後可以獲得Brix≥75，固形物中總低聚糖≥50％的FOS糖漿，整個工藝簡化，操作便利，生產成本明顯下降。