生精細胞檢測作為一項新研發的技術，對男性不育臨床醫學診斷治療有了巨大的突破。目前在國內尚未被全面的引進。生精細胞檢測，彌補了以往不育檢測技術的不足，還給治療不育帶來了希望和光亮。臨床醫療、教學、科研工作生涯錘鍊了紮實獨到的細胞形態學基本功，加以其豐富的臨床經驗積累，成為國內知名的專家，率先在國內開闢了男性學的臨床與實驗室檢測研究。
基本介紹
- 中文名：生精細胞檢測
- 提出者：曹興午
- 套用學科：男科
- 適用領域範圍：醫療
- 適用領域範圍：不孕不育
- 檢測範圍：生精細胞
技術,精原細胞,精母細胞,精子細胞,精液細胞檢測,異常細胞表現,臨床意義,
技術
生精細胞檢測技術是由中國男性不育專家曹興午教授創立的。曹興午教授，曾任北京中日友好醫院男科主任，現任中國性學會常務理事、性醫學專委會秘書長、學術工作部副部長；《中國性科學》、《中國醫學檢驗》、《中國社區醫學》等三種雜誌編委、研究員。參編20部著作，發表論文近100篇，科普文章400篇，曾多次獲優秀論文獎勵。從醫五十多年來通過在北京協和醫院，北京中日友好醫院的臨床醫療、教學、科研工作生涯錘鍊了紮實獨到的細胞形態學基本功，加以其豐富的臨床經驗積累，成為國內知名的專家，率先在國內開闢了男性學的臨床與實驗室檢測研究，其中有關精液細胞學和精子形態學的分析資料對我國泌尿外科、男科事業的發展做出了卓越貢獻，曹教授率先在國內提出應當重視精子形態學與精液細胞學檢查在診斷男性不育、評價男性生殖功能的臨床價值。
生精細胞(germ cells)，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子。實質上這是一個連續的分化發育過程，稱為精子發生。
精原細胞
精原細胞(spermatogonia)是成熟睪丸中最幼稚的生精細胞，位於曲細精管生精上皮的最外層。直接與曲細精管基膜相接觸。根據精原細胞核的形態、大小，染色質的染色及緻密度，核仁的位置及數量，胞質中有無糖原等形態結構特點，一般精原細胞分為三型：暗型精原細胞(dark type A，Ad)、亮型精原細胞A(Pale type A, Ap)和B型精原細胞(type B)。
Ad型精原細胞核呈圓形或卵圓形，染色質呈細粒狀，深染，核中常有1—2個淺染區，核仁明顯，胞質中有糖原及微管，還有Lubarsch氏晶體，它是由很多小管組成，每個小管直徑約為8—12μm，互相平行，並由緻密物質連結起來形成片層狀結構。AP型精原細胞大而圓，附於基膜，核圓形，染色質呈細顆粒狀，核淺染，有l—2個核仁，緊貼核膜，胞質中無糖原，無微管，無Lubarsch氏晶體。在鄰接的Ap型精原細胞間有橋粒樣結構。在Ad型精原細胞中，線粒體常成堆分布，線粒體間有深染的電子緻密物質將線粒體連結在一起。在Ap型精原細胞中可單個存在，也可成雙存在，相互間有緻密物質連結。
B型精原細胞圓形與曲線精管基底膜接觸面較少，有時僅有一個狹窄的胞質突起與之接觸。核球形，核染質呈顆粒狀，大小各異，沿核膜分布或附於核仁。核仁不規則，一般位於核中心，線粒體分散在整個胞質中。根據超微結構和組織化學的研究，在人的精原細胞核中，存在幾種小體。在B型精原細胞中，除了幾個核仁之外，還有碎片狀染色質，缺乏固定的結構。在A型精原細胞核中有五中不同的小體，分別稱為I、Ⅰ型、Ⅱ型，Ⅲ型及Ⅳ型，Ⅴ型小體。I及Ⅰ型小體具有核仁結構成分，主要存在於核染質較淡的核中。Ⅱ型小體最常見，常存在於有中央空泡的核中。Ⅲ型及Ⅴ型小體被認為是非典型核仁。Ⅳ型小體是一些小的緻密的染色質。不同類型的精原細胞實際上反映了精原細胞的連續的增殖過程。各種類型的精原細胞間存在著恆定的數量關係，Ad型與AP型之間為I與Ⅰ之比，Ad與B型，Ap與B型之間為2與l或4與1之比。通過放射自顯影研究發現Ad型精原細胞周期很長，分裂很慢。因而認為Ad型精原細胞是生精細胞的幹細胞。由此人們提出了精原細胞增殖的模式。根據這個模式，一個生精幹細胞通過第一次有絲分裂，產生兩個新的Ad型精原細胞。其中一個Ad型精原細胞再分裂產生兩個Ad型精原細胞，而另一個Ad型精原細胞則分裂產生兩個AP型精原細胞，繼而又先後分裂分化形成B型精原細胞及初級精母細胞。
精原細胞的增殖具有重要的生理意義。在增殖過程中，通過精原細胞的分裂和分化，由精原細胞產生精母細胞，進入成熟分裂，因而通過增殖可大大增加精母細胞的數量。按理論推算，一個精原細胞通過數次細胞分裂，可形成上百個初級精母細胞。但在生精過程早期，生精細胞很易發生變性，故實際上少於這個數字。在精原細胞的增殖過程中，有一部分Ad型精原細胞不再繼續分裂，而是保留下來，成為新的精原幹細胞，因此通過增殖不僅能使精原幹細胞不斷得到更新，且能使精原幹細胞保持一定數量，從而使精於發生持續地進行下去，不會枯竭。
關於精原幹細胞問題，筆者認為Ad型精原細胞不是精原幹細胞。有一種長型精原細胞(簡稱AL)才是真正的幹細胞。AL型精原細胞很扁，與曲細精管基膜接觸面積最大，有很多特徵與Ad型精原細胞相類似．所不同的是，AL型精原細胞核膜外形沒有Ad型規則，核電子密度較低，核中無稀疏區。
精母細胞
精母細胞位於生精上皮中層，分初級精母細胞(Primary spermatocyte)和次級精母細胞(secondary spermatocyte)兩種。各種精母細胞又處於細胞周期的不同階段，因此在切片上可看到不同形態的精母細胞。
由B型精原細胞直接分裂形成的初級精母細胞，稱為前細線期精母細胞，其細胞結構特點和B型精原細胞相類似，體積稍大，開始時同曲細精管基膜還有少量接觸，進而完全離開基膜。支持細胞的突起將前細線期精母細胞同基膜和鄰接細胞相隔開。前細線期精母細胞被認為是靜止期細胞。其實，它除了複製DNA外，還積極參與轉錄和轉運，合成在精子發生過程中需要的大部分蛋白質和酶，並進行貯存，因而細胞質增多，細胞體積增大，可達18μm左右。不久即進入成熟分裂，由於其分裂前期很長，可達22天以上，因此在切片上可以看到大量的處於分裂前期的初級精母細胞。從初級精母細胞開始，細胞器增多，高爾基體發達，線粒體逐步變成為泡狀線粒體。胞質密度比精原細胞深。
初級精母細胞經第一次成熟分裂，形成兩個次級精母細胞。體積較小，直徑約8—9μm。核球形，染色質呈細網狀，但也可有一些大的染色質顆粒。次級精母細胞的間期很短，很快進行第二次成熟分裂，故在切片上所看到的多為分裂期的次級精母細胞，間期者不易看到。
成熟分裂(meiossis)，又名減數分裂。這是生殖細胞發育過程中特有的一種細胞分裂方式，它包括了兩次連續的細胞分裂，即初級精母細胞的第一次成熟分裂和次級精母細胞的第二次成熟分裂。初級精母細胞的染色體是雙倍體(44+xY)，有44條常染色體及2條性染色體(X和Y)。在細胞分裂間期或細線前期，初級精母細胞複製DNA，使DNA的量達到4n。接著細胞進入分裂期。
細胞分裂期分前期、中期、後期和末期。前期持續時間可長達24天。在前期，初級精母細胞核染色質變化很複雜。根據染色質的形態變化，可分為細線期、合線期、粗線期、雙線期和終變期。在細線期，染色質濃縮，形成細絲狀染色體。然後進入合線期，來自兩個親本的同源染色體雙雙配對，聯結在一起，構成一對對較粗的染色體複合結構，稱雙價體或聯會複合體，這種現象叫聯會(synapse)。在電鏡下，聯會複合體呈二分體結構：兩側為兩條平行的電子緻密粗線，中間為電子透亮的細絲。在合線期，染色體螺旋進一步變緊，於是染色體進—步變短變粗，染色加深，同源染色體全部配對聯結在一起，並且每條染色體出現明顯縱裂，使每條染色體均包涵有兩條染色單體。由著絲粒將它們聯結在一起。接著進入雙線期，染色體變得更加粗短，同源染色體對開始分離，但分離不完全，相互間有交叉點相連，這種現象稱為染色體交叉。這不是一種簡單的同源染色體間接觸，而是通過染色體交叉，在來自父系和母系的同源染色體間進行遺傳物質的交換，具有重要的生物學意義。至終變期，同源染色體對明顯分離，核仁核膜消失，同源染色體對排列於赤道板上，位於細胞兩端的中心粒發出紡錘絲，連於染色體，構成紡錘體。在分裂後期，同源染色體各沿著染色體臂，移向細胞兩極。到末期，核仁核膜又出現，胞體分成兩半，終於形成兩個子細胞——次級精母細胞。每個次級精母細胞染色體數為23條，為單倍體，比原來減少一半，這時DNA為2n。
次級精母細胞形成後很快進入分裂間期，但為期甚短，不複製DNA，就進行第二次成熟分裂。次級精母細胞的23條染色體均由兩條染色單體組成，染色單體間由著絲粒相連。第二次成熟分裂時，著絲粒斷裂，染色單體分別移向細胞兩極。一個次級精母細胞經過第二次成熟分裂，形成兩個精子細胞。其染色體數為23條，單倍體，DNA為ln。
精子細胞
精子細胞(spermatid)靠近管腔，呈球形，體積較小，約9μm，為初級精母細胞的一半大小，但核相對體積較大，約6μm，圓形，位於細胞中央，染色質呈細顆粒狀，染色淡。在胞質中可見一系列細胞器：線粒體較少，沿著細胞膜排成一圈。還有中心粒、內質網和高爾基體等。高爾基體是精子細胞中一種活躍的細胞器，它是聯繫各種細胞器的一個中心環節。在精子形成過程中起重要作用。在形態上，高爾基體有兩個明顯不同的部分—皮質和髓質。高爾基體外周部分是皮質，它由幾個扁平膜囊堆組成，面向細胞核彎曲成弓形。高爾基體皮質—內質網—溶酶體系統(GERL)。高爾基體髓質由一些形狀不同、大小不等的泡狀與管狀結構組成。在精子發育過程中，高爾基體的超微結構有著規律性的變化。
精子細胞不再分裂，但要經歷一個形態結構的複雜變化過程，才形成蝌蚪狀的精子，這個過程稱精子的形成(spermiogenesis)。在形態上，哺乳動物的精子發育過程一般分為四個時期，即高爾基期、頂帽期、頂體期和成熟期。
1．高爾基期(Golgi stage) 在高爾基期，開始高爾基體呈球形，以後變成半球形，位於細胞核的一側。在高爾基期的主要特徵是在髓質內先出現幾個圓形小泡，稱前頂體囊泡，內有緻密的顆粒稱前頂體顆粒。隨後這些前頂體囊泡融合成一個大的頂體泡與核膜相貼，稱頂體囊泡，前頂體顆粒也融合成為頂體顆粒，這時在高爾基體髓質內或髓質附近還可見多泡體結構。它常與核外染色質伴隨。以後多泡體與核外染色質一起離開高爾基體，移向細胞核尾側中心粒(如下圖)。
2．頂帽期(cap stage) 在頂帽期頂體變成扁平狀，覆蓋於精細胞核表面。頂體泡擴大並向細胞核兩側延伸形成頂帽。此時頂體顆粒並不增大，仍位於原來的部位，頂體顆粒與頂帽一起稱為頂體系統。到這期末．頂帽可包繞細胞核的前半。在頂帽期的精子細胞中，高爾基體體積增大，CERL高度發育，多泡體移到細胞核尾側的中心粒附近。
3．頂體期(acrosome stage)在頂體期頂體帽進一步擴大，頂體物質彌散於整個頂體帽中，於是頂體帽變成了頂體。高爾基體離開頂體系統與細胞核，在形態上由半球形變成球形，GERL退化並消失。與此同時，細胞核由細胞中央部位移向細胞一端，形態由圓形變為扁平的梨形，體積逐步縮小，染色質顆粒逐步增粗，電子密度逐步增強，最後形成緻密均質狀結構。在精子細胞核伸長和濃縮期間，大量的賴氨酸從核膜逸出，以攝入的精氨酸代之，使精子細胞核蛋白結構發生顯著改變。精子細胞核內與DNA結合的是富於精氨酸的鹼性蛋白質，可以抑制核中RNA的合成，從而抑制核內基因的轉錄，使基因更為穩定，具有保護作用。 當頂體形成時，細胞質內的兩個中心粒遷移到與頂體相對的一端。從遠側中心粒長出一根細長的軸絲，形成了鞭毛；近側中心粒貼近核尾端，圍繞鞭毛的基部形成一緻密的終環。線粒體聚集在核與終環之間的鞭毛周圍，形成螺旋狀的線粒體鞘。
4．成熟期 精子細胞的部分細胞質濃縮成為不規則的細胞質塊，連於尾部中段，稱多餘胞質。進一步脫去多餘胞質，至此精子形成並離開支持細胞，釋放至曲細精管管腔。脫下的多餘胞質稱殘餘體。在成熟期，高爾基體再次由球形變成半球形，並開始退化，碎裂直至消失。
根據精子細胞核的形態變化，又可將精子細胞分成四種類型：
精子細胞Sa型：精子細胞直徑6—7μm，核圓，位於細胞中央，染色質呈細粒狀，染色較淺，但也有散在的不規則的塊狀染色質。用PAS染色，在核的一端有一圓形小區是PAS陽性反應。這一型相當於高爾基期。因此在電鏡下可見高爾基期的一系列超微結構特點。
精子細胞sb1型：涉及到頂帽期和頂體期。核體積變小，核染色質開始變緻密而不規則，位於核一端的帽狀PAS陽性區更為明顯。在電鏡下發現，頂體顆粒可仍位於頂體囊泡中央，頂體囊泡在核的前端擴延，形成頭帽，隨後頂體顆粒散在於整個頭帽並充滿頭帽，於是形成頂體，覆蓋核的1/3。
精子細胞Sb2型：高爾基體己離開核上區，核向前移動造成核的偏位現象。核形改變伸長成梨形。由於核的進一步移動，外頂體膜與細胞一端的胞質膜相接觸。在與頂體相對的另一極，開始形成鞭毛。
精子細胞Sc型：其核進—步變長。在核內明顯出現電子緻密顆粒，粗約25—35μm，散在分布，核電子密度加深，但在核後區較透亮。
精子細胞Sd1型：染色質顆粒增粗，體積縮小。
精於細胞Sd2型：已接近成熟，染色質顆粒融合形成均質的緻密團塊。
精液細胞檢測
精液中的生精細胞主要包括4類：①精原細胞：可分為3種類型（Ad、Ap及B型），Ad型（暗A型）精原細胞的核圓形或橢圓形，核內有許多細小染色質顆粒，可被鐵蘇木素深染。核中央有一塊蒼白區，不被染色。核膜內表面有半球狀核仁，通常1~2個，大小不一，嗜伊紅。胞質內常出現空泡，富含糖原顆粒，過碘酸反應呈強陽性。Ap型（亮A型）細胞核呈卵圓形，核內染色質顆粒較大，不易被鐵蘇木素著色。核膜處有1~3個核仁，嗜伊紅。與Ad型細胞明顯不同的是胞質內糖原顆粒極少，過碘酸反應呈陰性。B型精原細胞核較大，圓形，染色質顆粒著色很淺，但有時出現一些小片狀或顆粒狀的染色質，染色較深，且部分常附著於核膜上，有時附著於核仁。胞質內無糖原顆粒存在。Ad、Ap型精原細胞一般不易離開基膜脫落，精液中見到的常是B型精原細胞。B型精原細胞是對放射線最敏感的細胞。②初級精母細胞：這一類型的生精停滯常出現在第一次減數分裂前期的末尾。精液中可見到偶線期的聯會（同源染色體配對）或晚粗線期的去聯會（配對的同源染色體片斷提前分離）細胞形態。
細胞體積較大，直徑15~24 μm。③次級精母細胞：由初級精母細胞增殖分化而來。體積一般較初級精母細胞小，有單核及雙核兩種類型，雙核形的細胞與蜻蜓的頭眼相似。胞核染紫紅色。次級精母細胞存在的時間很短，故切片中少見。④精子細胞：由次級精母細胞發育成熟而來。精子細胞變態成精子的過程包括8個不同階段。精子細胞形態多樣，核較小，著色較深，常呈球形或精子頭的雛形。精液中生精細胞檢查是評價男性生育能力的重要指標，也是判斷阻塞性和非阻塞性無精子症的重要依據。
生精細胞的檢查首先離不開塗片，液化精液3 000 g離心15分鐘後，將上層精漿倒出，沉澱用生理鹽水懸浮洗滌1~2次後，用生理鹽水將精子調整到一定濃度後（約50×109/L）塗片，自然乾燥或用電吹風吹乾。少精子症和無精子症標本可直接用沉澱塗片，無需用生理鹽水洗滌。
塗片中生精細胞的檢查離不開染色，用於生精細胞分析的染色方法主要有：瑞－吉氏染色法、改良巴氏染色法和HE染色法。這些染色方法可參見精子形態學分析一節。
結果判讀：根據細胞核的形態與大小，染色質固縮程度以及核漿比例可將生精細胞分為四種：精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞和精子細胞。在精液中除可觀察到正常形態特徵的生精細胞外，還可觀察到異常生精細胞。
異常細胞表現
①胞核變性：這是異常生精細胞的主要特徵。由於胞核受損，分化不良，瑞－吉氏染色核呈深紫色，可見到核固縮、溶解和核斷裂等形態特徵。核固縮，常使核變小、緻密，均勻著色；核溶解，常呈胞核膨脹、疏鬆，染色質模糊，著色較淺，或核膜破碎，輪廓不清；核斷裂，可見胞核呈斷裂狀態或為幾個核碎片，明顯可見著色深淺分明的斷裂塊。
②胞質破損：胞體變形腫大或縮小，甚至破碎，形態多樣異常，胞質內空泡大小不一，著色深淺不一。常見有深紫色大小不一的顆粒，有時核裸露，偶見精子穿入生精細胞的胞質內。
③核分裂異常：生精細胞核分裂異常，可見有核內複製現象。在次級精母細胞、精子細胞階段，有時可見三個或四個以上的核，有時可見核漿發育不平衡的生精細胞，核漿比例失調。
臨床意義
①精液中生精細胞的檢查能有效地與精液中其他細胞（如白細胞）區別，避免誤診。
②精液中生精細胞的檢查結合精漿生化指標測定可鑑別阻塞性無精子症和非阻塞性無精子症，並可反映睪丸的生精功能。
③精液生精細胞檢查可取代睪丸活檢。採用睪丸活檢觀察生精細胞形態學，不僅給患者帶來痛苦，而且易使患者體內產生抗精子抗體。
④可了解細胞毒類藥物、溫度等因素對生精細胞的影響。
⑤動態觀察精液生精細胞的變化，可以作為男性不育症療效觀察和判斷預後的指標之一。
