生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法:專利背景,發明內容,專利目的

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》是廣州銘康生物工程有限公司於2002年7月19日申請的專利，該專利的公布號為CN1468862，申請號為021344043，授權公布日為2004年1月21日，發明人是劉龍斌、楊琴、王敏榮、王軍志。

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》公開了一種生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，該方法採用全長基因合成的方法合成含上述突變位點的TNK－tPA基因，在中國倉鼠卵巢細胞（CHO－DHFR）中表達，經克隆和篩選獲得高水平表達TNK－tPA的工程細胞株，利用細胞培養生物反應器持續培養工程細胞，收集細胞培養上清，經一系列柱層析分離純化技術，獲得rhTNK－tPA製品。該發明的目的基因在細胞中的表達水平高達18000IU/10cell/d，由此製備的rhTNK－tPA的單鏈比例高達80％以上，純度高達95％以上；對於工業化規模而言，該發明所需的設備相對比較簡單，成本低，工藝條件簡單。

2018年12月20日，《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》獲得第二十屆中國專利優秀獎。

（概述圖為《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》摘要附圖）

基本介紹

中文名：生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法
公布號：CN1468862
授權日：2004年1月21日
申請號：021344043
申請日：2002年7月19日
申請人：廣州銘康生物工程有限公司
地址：廣東省廣州市經濟技術開發區友誼路173號
發明人：劉龍斌、楊琴、王敏榮、王軍志
Int.Cl.：C07K14/435；C12N15/09；C12P21/02
代理機構：廣州知友專利代理有限公司
代理人：邵毓琴
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

組織型纖溶酶原激活劑（Tissue Plasminogen activitor，簡稱t-PA）是人體血液中凝血和溶纖系統的重要組分之一，它通過激活血栓表面的纖溶酶原而啟動溶纖系統，在維持凝血和溶纖平衡中起著重要作用。t-PA由血管內皮細胞合成，新合成的t-PA前體由562個胺基酸殘基組成，在多肽的翻譯、分泌和成熟過程中，N端的信號肽和前導肽被切除，成熟的t-PA分子含527個胺基酸殘基，分子量為67-72KD，由單條肽鏈組成，含17個二硫鍵。在溶纖過程中，t-PA分子在Arg275-Ile276位置被蛋白酶切割，形成活性更高的雙鏈分子，N端275個胺基酸殘基形成重鏈，C端252個胺基酸形成輕鏈，輕、重鏈之間由一個二硫鍵相連。重鏈含4個結構域，它們分別與其他一些血漿蛋白的某些功能域高度同源，所述的4個結構域分別是：1、指形區（又稱F區），由4～46位胺基酸殘基組成，與纖維結合素（fibronectin）的指形區同源，含纖維蛋白結合位點。2、表皮生長因子區（又稱E區），由47～85位胺基酸殘基組成，序列與表皮生長因子同源，含細胞膜受體結合位點。該區介導t-PA與肝細胞和血管內皮細胞結合，對半衰期有重要影響。3、K1區，由92～173位胺基酸殘基組成。4、K2區，由180-261位胺基酸殘基組成，含纖維蛋白結合位點。輕鏈與胰蛋白酶高度同源，含絲氨酸蛋白酶結構域，由His322、Asp371和Ser478組成活性中心，催化纖溶酶原轉化成纖溶酶。t-PA分子含4個可能的糖基化位點：Asn117、Asn184、Asn218、Asn448。天然型t-PA分子含除Asn218外的其他三個糖基位點。根據糖基化的方式可將t-PA分子分為兩個型：I型在三個位點均糖基化，II型則在Asn184位點無糖基化，二者在體內的含量基本相同。

t-PA在體內至少和以下4種不同蛋白質相互作用：1、纖溶酶原，它是t-PA的底物，在無纖維蛋白時，t-PA與它僅有較低的親和力。2、纖維蛋白，t-PA分子與其有較高的親和力，並且在與其結合後t-PA的蛋白酶活性可提高100倍左右。3、纖溶酶原激活劑抑制物PAI，t-PA與其結合後蛋白酶活性受抑制。4、t-PA受體，存在於肝細胞和血管內皮細胞表面，介導t-PA在體內快速清除。由於t-PA與纖維蛋白具有高度親和力並且其活性可被纖維蛋白大大提高，因此，它在一定的濃度範圍內只激活血栓附近的纖溶酶原，使血栓溶解，而不會引起全身的出血傾向，因此t-PA比其他的纖溶酶原激活劑更加安全有效。

重組人組織型纖溶酶原激活劑是利用基因工程方法對上述天然蛋白進行改造而得到的突變體或嵌合體。其中，TNK-tPA突變體的突變位點及其相應的功能分別是：

將T103（蘇氨酸）位點突變為N103（天冬醯胺），使其由非糖基化位點變為糖基化位點，降低了t-PA在血漿中的清除速度，延長了半衰期，但這種突變也降低了t-PA與纖維蛋白的結合能力。

N117（天冬醯胺）位點突變為Q117（谷氨醯胺），去除117位點的糖基化功能，這種改變修復了N103位點突變對纖維蛋白專一性的不利影響，並且也降低t-PA在血漿中的清除速度。

K296（賴氨酸）、H297（組氨酸）、R298（精氨酸）、R299（精氨酸）位點突變為A296（丙氨酸）、A297（丙氨酸）、A298（丙氨酸）、A299（丙氨酸），增強了t-PA對纖維蛋白的結合能力，最重要的是使t-PA對其抑制劑PAI-1具有拮抗作用。

上述TNK-tPA突變體與天然型相比，對抑制劑PAI-1的拮抗能力增強了80倍；與纖維蛋白結合能力是天然型的10～14倍；血漿清除速度降低了4倍。

截至2002年7月，通常採用大腸桿菌系統表達t-PA缺失突變體，該技術是通過DNA重組技術，缺失天然t-PA分子的部分功能域，如F區、E區、K1區，使之僅含有K₂功能域和蛋白酶功能域。此缺失突變體t-PA是一個單鏈、非糖基化的分子，在大腸桿菌中表達。相對於天然t-PA，其在體內的半衰期延長了4～5倍，但與纖維蛋白的結合能力降低了5倍。因此在臨床套用上有一定的局限性。

對於重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體rhTNK-tPA的生產方法2002年前尚無文獻報導。

發明內容

專利目的

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》的目的是提供一種生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法。

技術方案

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》採用全長基因合成的方法合成含上述突變位點的TNK-tPA基因，在中國倉鼠卵巢細胞（CHO-DHFR）中表達，經克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株，利用細胞培養生物反應器持續培養工程細胞，收集細胞培養上清，經一系列柱層析分離純化技術，獲得rhTNK-tPA製品。

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》依次包括以下步驟：

（1）定點突變天然t-PA基因獲得含突變位點的TNK-tPA突變體基因；

（2）構建表達載體pCdhfr；

（3）以XhoI/XbaI雙酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，與以XhoI/XbaI雙酶切的真核表達載體pCdhfr連線，轉化大腸桿菌E.coliJM109，以載體上的通用引物做PCR初步篩選克隆，取陽性克隆株培養，得到重組表達質粒pCdhfr-mt-PA；

（4）以TNK-tPA突變體表達質粒pCdhfr-mt-PA轉染CHO（dhfr）細胞，經克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株；

（5）利用細胞培養生物反應器持續培養工程細胞，收集細胞培養上清，經分離純化獲得rhTNK-tPA突變體。

改善效果

1、《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》的目的基因在細胞中的表達水平高達18000IU/10cell/d。

2、按照《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》的分離純化工藝製備的rhTNK-tPA的單鏈比例高達80％以上，純度高達95％以上。

3、對於工業化規模而言，《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》所需的設備相對比較簡單，成本低，工藝條件簡單。

附圖說明

圖1是《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》的實施例中TNK-tPA真核表達質粒的酶切分析圖。

圖1

技術領域

《生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法》涉及一種生產重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體的方法，特別是涉及一種利用動物細胞生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體（簡稱rhTNK-tPA）的工藝方法。

權利要求

1.生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，依次包括以下步驟：

（1）定點突變天然t-PA獲得含突變位點的TNK-tPA突變體基因；

（2）構建表達載體pCdhfr；

（4）以TNK-tPA突變體表達質粒pCdhfr-mt-PA轉染CHO（dhfr）細胞，經克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株；

（5）利用細胞培養生物反應器持續培養工程細胞，收集細胞培養上清，經分離純化獲得rhTNK-tPA突變體。

2.根據權利要求1所述的生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，其特徵是：所述的表達載體pCdhfr是由pCI-neo改構而成，pCdhfr的dhfr基因cDNA來源於質粒pSH2；pSH2用BglII消化後，Klenow酶補平3′凹端，再用HindIII酶切，於低熔點瓊脂糖中分離0.7kb的片段；載體pCI-neo先用BstXI酶切，然後用T4DNA聚合酶削平3′凸端，再用HindIII酶切，採用三片斷相連，將上述0.7kb的dhfr基因亞克隆到HindIII/BstXI位點，得到攜帶dhfr的共擴增表達載體pCdhfr。

3.根據權利要求1所述的生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，其特徵是：在所述的步驟（5）中，rhTNK-tPA突變體的分離純化步驟依次為：

（1）過濾；

（2）Zn--POROS20MC螯合層析純化；

（3）LysineHyperD親和層析；

（4）SephadexG-25凝膠過濾層析。

實施方式

1、工程細胞株的構建

1.1材料、方法和結果

11.1材料

1.1.1.1菌種

E.coliXL1-Blue（基因型hsdR17，supE44，recA1，endA1，gyrA46，thi，relA1，lac/F′[proAB+，lacIq，lacZDM15∷Tn10（tetr）]）。

1.1.1.2細胞系

CHO（dhfr），二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞。

1.1.1.3工具酶

各種限制性內切酶、T4DNA連線酶、鹼性磷酸酶、TaqDNA聚合酶，均購自Promega公司。VentDNA聚合酶購自Biolab公司。DNA分子量標準DL2000（2000，1000，750，500，250，100bp）及lamda-DNA/EcoRI（23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125bp）購自寶生物工程大連有限公司。

1.1.1.4主要試劑

1.1.1.4.13mMHT（次黃嘌呤+胸腺嘧啶）濃縮液

次黃嘌呤（購自Sigma公司）40.83毫克，胸腺嘧啶（Sigma公司）72.7毫克，加純水50毫升，逐滴加入1N氫氧化鈉。

1.1.1.4.2IMDM培養液

IMDM粉（購自Hyclone公司）17.7克，NaHCO₃2.0克，加入950毫升純水，攪拌至完全溶解，以1NHCl調pH至7.6，加水至1000毫升，4℃保存，使用前加10％的透析胎牛血清（購自Hyclone公司）及雙抗。

1.1.1.4.3磷酸鹽緩衝液（PB）

Na₂HPO₄	7.1克
NaH₂PO₄2H₂O	1.79克
Tween-80	0.1毫升
NaN3	0.2克

1.1.1.4.4牛凝血酶溶液

取10000U/支凝血酶（購自Sigma公司），用PB稀釋至330U/毫升，分裝，-20℃保存備用。

1.1.1.4.5牛纖維蛋白溶酶原溶液（P液）

取牛纖維蛋白溶酶原（100U/支，購自Sigma公司），加PB稀釋至0.1毫克/毫升，分裝，-20℃保存備用。

1.1.1.4.6牛纖維蛋白原溶液（F液）

將-20℃保存的纖溶酶原放置室溫半小時以上，稱取所需量溶於煮沸後降至37℃的PB緩衝液中，使其終濃度達2毫克/毫升，37℃保溫至完全溶解。

1.1.1.4.7標準品溶液製備

取標準品，用PB稀釋至以下濃度，3000IU、1500IU、750IU、375IU、187.5IU、93.25IU/毫升。

1.1.1.4.8TNK-tPA樣品的稀釋

取待檢樣品，用PB稀釋至0.1微克/毫升左右。

1.1.2主要儀器設備

高速台式離心機	TGL-16G	上海安亭
高速台式冷凍離心機		Sigma
高速冷凍離心機		Beckman
恆溫水浴箱	DT75-1	國產
CO₂孵箱		Sanyo
超淨工作檯		國產
倒置光學顯微鏡		國產
PCR擴增儀		PERKINELMER
SorvallRC5Cplus高速冷凍離心機		DUPont
DF-C恆壓恆流電泳儀		北京東方儀器廠
超音波細胞粉碎儀		寧波超聲儀器廠
酶聯儀Model450		BIO-RAD
Spectronic601紫外分光光度計		Milton
轉移電泳儀		BIO-RAD

11.3方法與結果

11.3.1目的基因的獲得

利用點突變技術定點突變天然t-PA基因，採取全長基因合成的方法合成含突變位點的TNK-tPA基因，即：將天然型t-PA基因（wtPA）編碼第103位Thr的ACG鹼基變為AAC/Asn（T103N），可以在此位點（K1區）形成一個人工的糖基化位點，該位點的形成導致t-PA在體內被清除的速度下降，然而該位點的突變導致與纖維蛋白的結合能力下降，從而降低其特異性；通過將117位AAC/Asn突變為CAA/Gln（N117Q），可以消除上述103位糖基化所造成的不利影響；此外，將天然型t-PA的296位Lys、297位His、298位Arg和299位Arg全部替換為Ala[KHRR（296-299）AAAA]，可以增強其結合纖維蛋白的能力，並降低其對PAI-1（t-PA抑制劑）的敏感性。

根據天然型t-PA的cDNA序列，設計上述突變位點，分別位於t-PA蛋白的103、117、296-299位胺基酸，導致上述位點的胺基酸與天然型t-PA不同。同時，在基因的上下游分別引入XhoI和XbaI限制性內切酶位點，基因全長為1.7kb，由寶生物工程大連有限公司合成。

11.3.2表達載體pCdhfr的構建

該表達系統所用的表達載體pCdhfr由pCI-neo改構而成。pCdhfr的dhfr基因cDNA來源於質粒pSH2。pSH2用BglII消化後，Klenow酶補平3’凹端，再用HindIII酶切，於低熔點瓊脂糖中分離0.7kb的片段。載體pCI-neo先用BstXI酶切，然後用T4DNA聚合酶削平3’凸端，再用HindIII酶切，採用三片斷相連，將上述0.7kb的dhfr基因亞克隆到HindIII/BstXI位點，得到攜帶dhfr的共擴增表達載體pCdhfr。

由於表達載體pCdhfr含dhfr基因，該質粒轉染CHO（dhfr-）細胞後，在氨甲喋呤（MTX）的作用下拷貝數下大大增加，可以帶動該質粒攜帶的外源基因的高效表達。該質粒含有多克隆位點，可用於外源基因的克隆，多克隆位點的上下游分別含有CMV啟動子和SV40Poly（A）位點，這些序列可使插入多克隆位點的外源基因獲得有效的表達。該質粒上還含有大腸桿菌的複製起始點和氨苄青黴素抗性基因，它們可以使該質粒在大腸桿菌中擴增。

1.1.3.3TNK-tPA重組質粒的構建及鑑定

以XhoI/XbaI雙酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，與以XhoI/XbaI雙酶切的真核表達載體pCdhfr連線，轉化大腸桿菌E.coliJM109，以載體上的通用引物做PCR初步篩選克隆，取陽性克隆株培養，小量、快速提取質粒，酶切分析其插入片段，結果表明：外源目的基因正確插入到表達載體中，得到重組表達質粒pCdhfr-mt-PA，其酶切分析如圖1所示。

同時，為了確認表達質粒中所插入的基因為TNK-tPA基因，並且其插入方向、DNA序列與設計的完全一致，對插入序列進行分析。結果表明，所插入的基因片段的序列與設計的完全一致。

1.1.3.4CHO（dhfr-）細胞的轉染及高表達細胞株的篩選

CHO（dhfr-）細胞的轉染採用脂質體法，轉染用試劑盒LipofectAminePlus購自LifeTechnologies公司，轉染操作參照試劑盒說明書。

以TNK-tPA突變體表達質粒pCdhfr-mt-PA轉染CHO（dhfr-）細胞，以含雙抗的選擇性培養液培養，每隔三天換一次培養液，直到大部分細胞死亡並從培養板上脫落，少數整合外源基因的細胞克隆在選擇性培養液上存活下來，並不斷分裂形成細胞集落（克隆）。從轉染到細胞克隆的形成需要2周時間。在細胞克隆生長過程中，收集各孔培養上清，檢測表達產物。選取表達量高的克隆，以胰酶消化，重新分入細胞培養板中，換用含MTX的選擇培養液進行培養，在培養過程中，大部分細胞死亡，又有少數細胞形成新的克隆。重複上述操作，將MTX濃度提高一個水平，在克隆的篩選過程中，MTX濃度從5×10M逐步提高到5×10M，相應地，t-PA表達水平也逐步提高，如表1所示。

表1 MTX加壓篩選過程中TNK-tPA表達水平的變化

表1

MTX濃度（M）	0	5×10	1×10	2×10	5×10	1×10	2×10	5×10
細胞克隆	4D1	3F5	6C3	2G5	5H1	2A6	3E9	3C7
TNK-tPA表達量（IU/10cell/d）	1481	4155	8236	10681	12952	17329	17564	18910

從以上結果可以看出：當藥物MTX濃度超過1×10M時，TNK-tPA表達量不再明顯升高，因此我們選擇MTX濃度為1×10M時篩選到的細胞株2A6作為工程細胞株，命名為CHO-G10。

2、工程細胞在細胞培養生物反應器中的培養和目的蛋白的分離純化

2.1材料、方法和結果

2.1.1材料

2.1.1.1胎牛血清

為Invitrogenlifetechnologies公司的透析型胎牛血清。

2.1.1.2小牛血清

為Hyclone公司的加強型小牛血清。

2.1.1.3細胞培養基

所使用的IMDM和CHO-S-SFMII無血清培養基均為Invitrogenlifetechnologies公司產品。

2.1.1.4純化填料

所使用的純化填料POROS20MC、LysineHyperD和SephadexG-25分別是PE公司、Invitrogenlifetechnologies公司和AmershamPharmacia公司的產品。

2.1.1.5主要試劑

（1）胰酶為Hyclone公司產品

（2）咪唑為天津科密歐科技公司產品。

（3）L-Arginine為Invitrogenlifetechnologies公司產品。

（4）正磷酸為廣州化學試劑廠產品。

（5）氯化鈉為廣州化學試劑廠產品。

（6）Tween20為SIGMA公司產品。

21.2方法與結果

2.1.2.1細胞復甦

按常規細胞復甦方法：從細胞庫中取出一支凍存細胞，迅速置37℃水浴中，邊輕輕搖動邊融化，待融化完畢後，立即消毒凍存管外壁，在潔淨工作檯內將細胞懸液轉移到約10毫升含有10％胎牛血清的IMDM培養基的細胞培養方瓶（T25）中，於37℃的5％CO₂孵箱中培養，第二天更換新鮮培養基，繼續培養1～2天后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態和密度，細胞折光性好、貼壁均勻、鋪滿瓶底85％以上時，即可進行細胞傳代擴增。

2.1.2.2細胞擴增

包括細胞在方瓶中的擴增和細胞在細胞培養生物反應器中的擴增兩部分。

首先，將T25中的細胞用胰酶消化後，按1:1的比例傳入T75細胞培養瓶中，培養1～2天，待其貼滿瓶底時，再按1:1的比例傳入T175細胞培養瓶中，之後按1:4的比例在T175培養瓶中擴增，依次為4、16、64個T175培養瓶。

然後，將此64個T175培養瓶中的細胞消化、並收集計數後，接種到細胞培養生物反應器中，用含10％小牛血清的培養基擴增培養，控制溫度為37℃，pH為7.2，溶解氧（DO）為50％，攪拌速度為70～150轉/分鐘。根據葡萄糖消耗和其它參數的變化來判斷細胞的生長情況。通常接種細胞2～3天后，開始灌注培養，初始灌注量為2L/天，然後根據葡萄糖消耗情況逐漸增加灌注量，連續灌注3天后，即可更換為無血清培養。

2.1.2.3細胞在反應器中連續灌注培養

細胞在反應器中完成擴增培養後，壓出有血清培養基，用P.B.S.清洗3次，換入無血清培養基進行連續灌注培養，灌注量在5～15L/天之間，持續培養30天左右，收穫細胞上清約300升/罐/批，rhTNK-tPA的表達水平平均在18000IU/10cell/d以上。所收穫的細胞培養上清轉入純化。

2.1.2.4rhTNK-tPA的分離純化

2.1.2.4.1過濾，將細胞培養收集的無血清培養上清經1.2微米微孔濾膜正壓過濾，去除細胞碎片。

2.1.2.4.2Zn--POROS20MC螯合層析純化

將已過濾的細胞上清進行吸附上樣，上樣完畢後，首先用流動相A（30mMP.B.S，0.01％Tween20，pH7.6）洗至上樣峰下，然後用流動相B（30mMP.B，1.5MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6）洗至雜蛋白峰下，最後用流動相C（30mMP.B，0.5MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6，0.3M咪唑）洗至目標峰下，收集目標峰。

2.1.2.4.3LysineHyperD親和層析

將上述目標峰收集液在LysineHyperD親和層析柱上吸附上樣，上樣完畢後開始洗脫。首先用流動相D（30mMP.B.S，0.01％Tween20，pH7.6）洗至上樣峰下，然後用流動相E（30mMP.B，1MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6）洗至雜蛋白峰下，最後用流動相F（30mMP.B，1MNaCl，0.01％Tween20，pH7.6，1ML-Arginine）洗脫目標峰，收集該目標峰。

2.1.2.4.4SephadexG-25凝膠過濾層析

將上述目標峰收集液在SephadexG-25凝膠柱上上樣，然後用流動相G（每1000毫升G液含60gL-Arginine，15g正磷酸，200毫克Tween20）洗脫，收集目標蛋白峰，即為rhTNK-tPA蛋白純品。

3、rhTNK-tPA的鑑定

3.1非還原SDS-PAGE測定rhTNK-tPA純度

採用SDS不連續電泳的方法測rhTNK-tPA純度。

分離膠濃度是10％；濃縮膠濃度是5％；樣品處理液是含0.5％溴酚藍、1％SDS、10％甘油pH6.8的Tris-HClbuffer。樣品與樣品處理液等量混勻，上樣量10微克（最大上樣量中蛋白含量不到10微克時則按最大上樣量上樣）。電泳採用恆流30毫安，電泳時間約60分鐘。電泳完畢用考馬斯亮藍法染色，其結果在68KD處有特徵電泳帶，根據掃描圖象的結果可以得到rhTNK-tPA純度約為98％。

3.2還原型SDS-PAGE測定rhTNK-tPA的分子量和單雙鏈比例

電泳：除樣品處理液加5％DTT外，其餘條件與非還原SDS-PAGE相同。

分子量計算：根據分子量的對數與相對遷移率R_f是線性關係，依據Marker可以擬出線性方程：logM.V＝k×R_f+a

用直尺測出電泳帶的遷移距離就可以得到相對R_f，代入上式即可得到蛋白分子量。

單鏈蛋白的分子量約為68KD，雙鏈蛋白的輕鏈約為36KD，重鏈約為42KD。根據掃描圖象即可得到單、雙鏈比例在8:2以上。

3.3Westernblot鑑定rhTNK-tPA

電泳採用非還原SDS-PAGE的方法，固定膜是PVDF膜（使用前用甲醇泡0.5分鐘，再用電極緩衝液漂洗0.5h），封阻液用10％BAS。轉移電流用恆壓100伏，轉移1.5小時。一抗是rabbitantirec-t-PA，二抗是羊抗兔IgG-HRP，顯色液是DAB；用預染Marker作分子量標誌。

其結果在68KD處有特徵帶。

3.4rhTNK-tPAN-端胺基酸序列測定

rhTNK-tPAN-端胺基酸序列測定結果顯示，N末端15個胺基酸順序為Ser-Tyr-Gln-Val-Ile-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-Gln-Met-Ile-Tyr，與理論值一致。

3.5rhTNK-tPA生物學活性測定（氣泡裂解法）

所用試劑：PBbuffer：29gNa₂HPO₄·12H₂O和3gNaH₂PO₄·2H₂O定溶1000毫升，pH7.4。2毫克/毫升纖維蛋白原溶液，0.1毫克/毫升纖溶酶原溶液，33IU/毫升凝血酶溶液。標準品（3000IU/毫升，1500IU/毫升，750IU/毫升，375IU/毫升，187.5IU/毫升，98.75IU/毫升）。

樣品處理：用PBbuffer稀釋到t-PA含量約為750IU/毫升。

操作：將0.12毫升凝血酶溶液和0.12毫升樣品（t-PA）混勻，冰水浴保存（下稱A液）。將1毫升凝血酶溶液和20μl纖溶酶原在試管中混勻，冰水浴保存（下稱B管）。取A液0.2毫升加入B管中，快速混勻，放入37℃恆溫，開始記時間。當氣泡上升到表面（全部，個彆氣泡沾到壁上可以不記）為終點，記錄時間。

根據文獻記載，該法Lg活性與Lg時間是線性關係的，因而可以擬合出線性方程。將樣品的數據代入既可以得出數據。

結果表明，細胞培養上清的rhTNK-tPA含量平均在18000IU/10cell/d以上，純品的rhTNK-tPA比活性為600,000IU/毫克。

3.6rhTNK-tPA臨床前動物試驗結果

臨床前動物試驗結果表明，rhTNK-tPA對犬急性冠狀動脈血栓、大鼠腹主動脈血栓、兔肺血栓、體外人血栓等有明顯的溶栓作用；對小鼠一般行為狀態、中樞神經系統作用不明顯，對豚鼠迴腸平滑肌收縮無影響；對犬心電圖、呼吸頻率和呼吸深度無影響；其獼猴藥代動力學參數和曲線與參比品相近。小鼠的急性毒性試驗表明，雌性小鼠的MTD大於3420.5毫克/千克，雄性小鼠大於3102.3毫克/千克；大鼠和犬的長期毒性試驗表明，對其毒性靶器官肝臟的毒性反應具有可逆性；局部用藥毒性試驗表明，犬注射部位血管形態無異常，在血管周圍軟組織內見少量陳舊性出血並胞漿內含有含鐵血黃素顆粒的巨噬細胞；致畸胎試驗表明，對妊娠母鼠和胎鼠有輕微的毒性作用，但無明顯的致畸胎性。

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