《甘草查耳酮A抗金黃色葡萄球菌生物被膜的分子機制》是依託吉林大學，由於錄擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：甘草查耳酮A抗金黃色葡萄球菌生物被膜的分子機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：於錄
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
金黃色葡萄球菌是引起人和動物感染的一種最主要的病原菌，其耐藥性的增強大大增加了治療難度，而生物被膜的產生是其致病性和耐藥性形成的重要原因之一。因此，找到有效的抗金黃色葡萄球菌生物被膜藥物已成為刻不容緩的任務。我們研究發現，中藥甘草的主要成份甘草查耳酮A對金黃色葡萄球菌生物被膜有顯著抑制作用，但其作用機制尚不清楚。本課題擬在生物被膜體外模型基礎上，藉助我們建立的藥物抗菌作用機制全基因組晶片高通量分析平台，考察模式菌ATCC 29213生物被膜在甘草查耳酮A壓力下的基因表達變化及其作用的代謝通路，通過明膠酶譜分析、靶基因Knock-out、螢光定量PCR、Western-blot等進行確證，用綠色螢光蛋白標記結合雷射掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞術觀察藥物對生物被膜微觀結構的影響，闡明甘草查耳酮A抗金黃色葡萄球菌生物被膜的分子機制，為甘草查耳酮A作為先導化合物進一步開發套用及新藥靶標篩選奠定基礎。
結題摘要
金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是引起人和動物感染的一種最主要的病原菌，其耐藥性的增強大大增加了治療難度，而生物被膜的產生是其致病性和耐藥性形成的重要原因之一。因此，找到有效的抗金葡菌生物被膜藥物已成為刻不容緩的任務。我們前期研究發現，甘草查耳酮A對金葡菌生物被膜有顯著抑制作用，但其作用機制尚不清楚。在本研究中，我們成功構建了體外生物被膜模型和體外生物被膜藥敏分析方法，通過剛果紅等實驗鑑定了21株金葡菌的生物被膜形成能力；通過肉湯二倍稀釋法考察了甘草查耳酮A對金葡菌的懸浮菌最低抑菌濃度（MICs）和最低殺菌濃度（MBCs），用瓊脂平板法測定了甘草查耳酮A的最低抑生物被膜濃度（MIBCs）和最低殺生物被膜濃度（MBBCs），通過雷射共聚焦從微觀結構考察了甘草查耳酮A對24 h、48 h生物被膜的清除能力，結果顯示甘草查耳酮A對金葡菌懸浮菌和生物被膜有較好抑制活性。通過分光光度計法和XTT法測定甘草查耳酮A對金葡菌的生長抑制曲線，選擇1 h 4 × MIBC用於金葡菌生物被膜晶片轉錄組學研究，基因表達譜分析表明：與懸浮菌相比，甘草查耳酮A作用導致被膜態菌817個基因的表達水平發生顯著變化（≥2 倍），其中355個基因上調，462個基因下調，其中甘草查耳酮A顯著抑制自溶素及相關轉錄調節基因、生物被膜形成基因的表達；另外，顯著影響細胞壁相關蛋白編碼基因、菌蛋白合成基因、莢膜多糖編碼基因、毒力因子等的表達；實時螢光定量PCR驗證了部分晶片結果，明膠酶譜分析在蛋白水平確證了甘草查耳酮A對菌株自溶素的抑制；構建了S. aureus ATCC 29213的ica（icaADBC及icaR）缺失菌株，進一步證明抑制ica表達確實可以降低金葡菌生物被膜的形成。總之，甘草查耳酮A通過抑制生物被膜形成基因ica及自溶素相關基因的表達兩個方面同時抑制金葡菌生物被膜的形成。另外，還利用項目研究過程中建立的多個平台和模型進行了適當的拓展研究，篩選到異歐前胡素等12種先導化合物或臨床藥物單獨（或組合）在體外、免疫細胞內或者動物模型體內有顯著抗細菌生物被膜和抗細菌毒力能力，並通過生物晶片技術及Western-blot、綠色螢光蛋白標記和流式細胞術等技術闡明了相應的作用機制。本研究在國際上首次闡明甘草查耳酮A的抗生物被膜分子機制，而拓展研究的新發現對抗生物被膜相關的新型抗菌藥物開發具有重要意義。
