《珠眉海棠轉錄因子MzWRKY調控鹽脅迫回響的分子機理研究》是依託中國農業大學，由孔瑾擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：珠眉海棠轉錄因子MzWRKY調控鹽脅迫回響的分子機理研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：孔瑾
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
鹽害是影響蘋果生產的重要因素，鹽脅迫回響機制的闡明將為蘋果的分子育種提供依據。珠眉海棠（Malus Zumi）是分布在東北地區的耐鹽蘋果砧木，項目組對珠眉海棠進行了耐鹽鑑定，並通過組織培養快繁了鑑定後的珠眉海棠。WRKY是近年來發現的關鍵鹽回響轉錄因子，它調控回響的分子機理尚待揭示。申請人已從珠眉海棠中克隆了耐鹽基因MzWRKY並初步驗證了它的功能。本項目在此基礎上，通過根癌農桿菌和髮根農桿菌轉化珠眉海棠，獲得超表達MzWRKY和表達沉默的轉基因植株。再根據轉基因植株的轉錄組的數據，篩選隨MzWRKY的上調、下調而表達變化的基因，通過生物信息學的分析和功能預測的再次篩選後，進行RT-PCR 初步驗證並克隆候選下游基因。通過瞬時和穩定的共表達試驗確認上、下游基因間的調控關係，同時通過凝膠阻滯電泳判斷是否存在直接的調控關係，揭示MzWRKY調控鹽應答的分子機理。
結題摘要
項目基本按原計畫進行，全部完成了項目計畫的工作。從耐鹽品種珠美海棠（Malus zumi Mats）中分離和克隆參與鹽脅迫應答的 MzWRKY 基因。獲得了超表達MzWRKY9的轉基因植株，通過chip-seq篩選出受到MzWRKY9基因調控的下游基因。通過chip-PCR和EMSA，分別進行了體內和體外的驗證，進一步證明MzWRKY9 直接調控WD1、WD2、WD3、WD4、WD5等。同時，在體內原位的瞬時轉化系統中證明，MzWRKY9抑制的WD1、WD2、WD3表達。結果如下： 1 本實驗從珠美海棠中克隆了11個MzWRKY 基因的開放閱讀框，分別為MzWRKY1、MzWRKY3、MzWRKY9、MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY11、MzWRKY17、MzWRKY22、MzWRKY25、MzWRKY39、MzWRKY40。MzWRKY1、MzWRKY17和MzWRKY22屬於第Ⅰ類WRKY轉錄因子；MzWRKY9、MzWRKY11、MzWRKY25和MzWRKY39屬於第Ⅱ類WRKY轉錄因子；MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY3和MzWRKY40屬於Ⅲ類WRKY轉錄因子。 2 檢測了這11個MzWRKY轉錄因子的轉錄活性。酵母系統的檢測結果表明，MzWRKY3、MzWRKY10-1、MzWRKY17、MzWRKY25和MzWRKY40具有轉錄激活活性；原生質體系統的檢測結果表明，MzWRKY9表現為轉錄抑制。 3 在擬南芥中超表達了MzWRKY9、MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY11、MzWRKY17、MzWRKY22、MzWRKY25、MzWRKY39、MzWRKY40等基因, 獲得了轉基因陽性植株。超表達MzWRKY9轉基因擬南芥幼苗對鹽脅迫敏感；超表達MzWRKY11和MzWRKY17轉基因擬南芥幼苗均對鹽敏感。 4在超表達MzWRKY9的嘎啦轉基因材料中，通過chip-seq篩選出受到MzWRKY9基因調控的下游基因。通過chip-PCR和EMSA，分別進行了體內和體外的驗證，進一步證明MzWRKY9直接調控WD1、WD2、WD3、WD4、WD5等。同時，在體內原位的瞬時轉化系統中證明，MzWRKY9抑制WD1、WD2、WD3的表達。
