玻片PCR

在聚丙烯管中可以對多種含模板材料進行PCR,而在顯微玻片上用組織細胞塗片或切片直接進行DNA 擴增的方法就稱為玻片PCR (Slide-PCR )。

先將細胞塗片或呈單層細胞,然後用甲醇/醋酸(3 :1,體積分數)、Carmoy溶液、無水乙醇或4%的多聚甲醛溶液固定5~ 15min。用蒸餾水沖洗,乾燥,直接使用或保存於-20C備用。在玻片上劃20mmx28mm作為免疫組化反應區。加人30ul PCR 反應混合液,其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KC1,1.5mmol/L MgCl2,200 umol/ldNTPs,100nmol/L 引物,0.01% (體積分數) 明膠,0.2% BSA,2.5u/100ul Taq 酶。然後蓋上22mm x40mm 的蓋玻片,邊緣用石蠟油封好。把玻片放人PCR 熱循環儀金屬塊上,使金屬塊與樣品呈最大程度接觸,同在聚丙烯管中一樣,進行30~ 40 個循環。對於較短的擴增片段在後期循環中變性溫度可降低。反應後,將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,但不取出蓋玻片,用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,在相對的一角中PCR 反應混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25 ul 混合液,將反應產物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引|物按標準PCR 進行重新擴增。玻片上擴增物可做原位雜交顯示。

在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來,然後在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環中DNA極微量,而30個循環後很豐富。常規細胞染色表明只有少量的形態改變。對於玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法,而不必再把這些樣品從玻片上刮下來,使操作簡便,污染減少。本方法對於原樣品量極微且需病史追蹤保存的樣品(如子宮頸塗片或塗片)具有實用價值。

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