《牛卵母細胞冷凍前後CD9表達量對精卵結合的影響》是依託中國農業大學，由侯雲鵬擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：牛卵母細胞冷凍前後CD9表達量對精卵結合的影響
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：侯雲鵬
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
牛卵母細胞冷凍保存對於牛體外胚胎生產和克隆具有重要意義，本課題組前期研究發現在精卵結合中扮演重要角色的四跨膜蛋白CD9在冷凍保存後分布發生變化，進而影響了精卵結合。本研究擬採用免疫印跡技術對冷凍前後GVBD期和MII期牛卵母細胞CD9的分布進行定量分析；擬通過對新鮮卵母細胞進行單克隆抗體或RNAi處理降低CD9表達量，對冷凍後卵母細胞進行外源CD9mRNA顯微注射導入後增加CD9表達量，探討CD9表達量對卵母細胞與精子的相互結合、融合能力的影響。本研究目標在於探明超低溫冷凍前後的不同成熟時期牛卵母細胞CD9表達量的變化，通過相關性分析驗證低溫打擊是否是冷凍保存過程中導致CD9分布及表達量變化的主要因素。本研究對受精生物學精卵結合理論研究具有重要意義，同時為提高牛卵母細胞冷凍後體外受精效果提供技術支撐，有利於繁殖生物技術的推廣和套用。
結題摘要
牛卵母細胞保存對於牛體外胚胎生產和克隆具有重要意義。本研究旨在探明跨膜蛋白CD9在牛卵母細胞與精子的相互結合與融合中所起的作用，並探討超低溫冷凍前後的不同成熟時期牛卵母細胞CD9表達量的變化，以及這種變化對超低溫冷凍牛卵母細胞與精子結合的影響。採用免疫印跡技術對冷凍前後MII期牛卵母細胞CD9的分布進行分析；通過qRT-PCR和western blot檢測CD9的表達；採用免疫螢光染色對冷凍前後牛成熟卵母細胞全基因組甲基化進行測定；並通過對卵母細胞進行單克隆抗體處理降低CD9表達量來探討CD9表達對卵母細胞與精子的相互結合與融合的影響。結果表明：CD9在新鮮牛成熟卵母細胞膜上呈均勻分布，卵母細胞冷凍後CD9在牛卵母細胞膜上仍有分布，但分布沒有新鮮組那么均勻。卵母細胞冷凍後，CD9 mRNA和CD9蛋白表達量顯著下降，而全基因組甲基化水平顯著上升。用CD9單克隆抗體對無透明帶的卵母細胞處理45min，然後進行受精，8小時後發現，每個卵母細胞結合的精子數僅為1.4±0.1個，而對照組每個卵母細胞結合的精子數則高達6.7±0.2個（P＜0.01）。當受精達到18小時時發現處理組卵母細胞的精子穿入率僅為23.7％（31/131），而對照組（未經CD9抗體處理）卵母細胞的精子穿入率則顯著較高，為78.5％（117/149，P＜0.01）。這些數據表明CD9參與精卵的結合與融合，並且超低溫冷凍保存引起的CD9表達量下降和全基因組甲基化上升是導致精卵結合與融合能力下降的重要原因。本研究結果進一步豐富了受精生物學精卵結合理論，同時為提高牛卵母細胞冷凍後體外受精效果提供技術支撐，有利於現代繁殖生物技術的推廣和套用。
