熱激活的質膜鈣通道CNGC6調控機制的研究

《熱激活的質膜鈣通道CNGC6調控機制的研究》是依託河北師範大學，由李冰擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：熱激活的質膜鈣通道CNGC6調控機制的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李冰
• 依託單位：河北師範大學

項目摘要

高溫脅迫對農作物生長發育造成嚴重危害，因此植物耐熱性機制的研究備受關注。細胞質中Ca2+濃度升高是植物應對高溫脅迫的早期回響。我們前一結題基金項目證明擬南芥環核苷酸門控的離子通道(CNGCs)蛋白家族成員CNGC6，介導熱誘導的質外體Ca2+內流並促進植物的耐熱性。然而，CNGC6鈣通道調節植物耐熱性的分子機制還不清楚。本課題以分子遺傳學、電生理學、細胞生物學和生物化學的方法，研究影響CNGC6鈣通道開放和關閉的調節因子，及CNGC6影響耐熱性的下游的分子途徑，旨在闡明熱激時植物細胞內Ca2+信號產生、轉導及耐熱性獲得的調控機制，完善我們前期提出的熱激信號轉導的鈣-鈣調素途徑。本研究對揭示植物耐熱性機制具有重要理論意義，並為利用生物技術方法提高植物耐熱性提供了可利用的基因。

結題摘要

我們先前的研究證明了擬南芥CNGC6是一個受熱激活的鈣通道蛋白，並且與植物的耐熱性相關。本課題進一步研究CNGC6鈣通道活性的調控機制。通過GUS報告基因分析及Real-time PCR方法所獲得的結果表明CNGC6基因在擬南芥中是泛在表達的。通過GFP報告基因分析的方法獲得的結果表明CNGC6蛋白定位在質膜上。通過real-time PCR方法比較了熱激後野生型、cngc6突變體、突變體恢復株系及CNGC6過表達株系中HSP18.2、HSP25.3及HSP70基因表達水平的差異，結果顯示cngc6突變體中以上3種HSPs的表達水平都略低於野生型，而恢復株系中3種HSPs的表達水平與野生型相似，過表達株系中3種HSPs的表達水平明顯高於野生型，表明CNGC6通過調節HSP基因的表達影響植物的耐熱性。進一步研究表明熱激後細胞內cAMP的含量迅速升高，並且這種熱激誘導的cAMP的產生是依賴腺苷酸環化酶的。以外源和內源cAMP處理野生型和cngc6突變體的原生質體，用膜片鉗技術檢驗處理前後的質膜鈣電導，結果表明CNGC6鈣通道可能受cAMP的激活。此外，Real-time PCR結果說明外源cAMP能夠代替熱激誘導下游熱激蛋白基因的產生，說明cAMP在熱激信號轉導中發揮作用。以鈣調素的拮抗劑CPZ和W7分別處理野生型和cngc6突變體的原生質體，用膜片鉗技術檢驗處理前後的質膜鈣電導，結果表明CNGC6鈣通道可能受CaM的反饋抑制。進一步，我們構建了cngc6突變體的恢復株系以及CaM結合位點缺失的CNGC6的轉cngc6突變體的恢復株系，並通過膜片鉗技術比較了熱激前後WT、cngc6突變體、cngc6/CNGC6株系和cngc6/CNGC6Δb株系的質膜鈣電流的大小，結果顯示熱激後cngc6/CNGC6Δb株系的質膜鈣電流比cngc6/CNGC6株系更大，進一步證實了CaM對CNGC6鈣通道的抑制作用。酵母雙雜交實驗結果表明CaM2/3/5和CaM7能與CNGC6相互作用，而CaM1/4和CaM6不能與CNGC6相互作用。pull-down 實驗在體外證實了這個結果，並且證明CNGC6上的CaM結合位點可能是IQ域，而不是CaMBD域。