深度蝕刻

深度蝕刻(quick-freezinganddeep-etching，簡稱QF-DE)技術可用於觀察組織細胞接近生活狀態的三維超微結構,被認為是電鏡領域劃時代的新技術。

基本介紹

• 中文名：深度蝕刻

簡介

電鏡標本製作過程中,人為地引起組織細胞發生不少變化,致使在電鏡下看到的超微結構,已與其生活狀態有相當差距,而且這些差距隨放大倍率的增高而加大,因而對組織細胞的生理構造及病理變化所做出的解釋難免有謬誤之處。Heuser等〔1,2〕創立的急速冷凍深度蝕刻(quick-freezinganddeep-etching,簡稱QF-DE)技術可用於觀察組織細胞接近生活狀態的三維超微結構,被認為是電鏡領域劃時代的新技術。國內雖早有李向印等關於快速冷凍復型技術的報導〔3〕,但之後未見進一步的研究報導。國外均用EikofD-3S以上新型冷凍蝕刻裝置進行研究〔4,5〕,而這些裝置價格昂貴,國內尚未引進。本文介紹QF-DE技術並探討套用國內已有的EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置能否製成QF-DE復型膜。

技術操作

取材

取新鮮腎皮質組織切成2mm×2mm×4mm小塊。

除去可溶性蛋白

方法有:①化學性膜處理法,將組織塊浸入0.02%～0.1%的皂角苷15～30min,皂角苷能溶解脂類物質,可引起細胞膜破壞,使細胞內可溶性蛋白流出。另外,由於皂角苷也溶解細胞內的膜性結構,因而此法僅適用於觀察不含脂質的細胞骨架等結構。②物理性膜處理法,將注射器針頭等銳器貼到玻璃片上,對組織進行研磨,破壞細胞膜,使細胞內可溶性蛋白流出。本法不破壞細胞內結構,適用於觀察細胞內膜性結構。

固定、沖洗

低濃度戊二醛(0.125%～0.25%)短時間(15～30min)輕微固定以更好地保存超微結構(此步亦可省略),然後以10%甲醇沖洗30s,防止冷凍時冰晶形成。

急速冷凍、冷凍割斷

用甘油將標本貼敷於標本托上,迅速置入異戊烷-丙烷混合液(-193℃)中冷凍。異戊烷-丙烷混合液的配製方法是,先將液氮盛於一較大容器中,然後將盛有異戊烷的玻璃杯放入液氮中冷卻,再將丙烷吹入異戊烷中,丙烷液化而形成異戊烷-丙烷混合液。冷凍後迅速將標本移入液氮中,並用冷卻後的手術刀割斷組織。

蝕刻、噴鍍

將標本置入冷凍蝕刻裝置中,在真空度-13300000～-133000000KPa、-95℃條件下蝕刻15～20min,使組織表層(10～20μm)的冰充分升華,顯露出埋在冰中的微細構造。組織細胞含大量水分,在冷凍過程中形成均勻一致的冰(玻璃化狀態),組織細胞的微細構造為這些冰所掩埋。在真空條件下,溫度上升可除去冰,這一過程即蝕刻。蝕刻速度因溫度而不同,-90℃為14nm/s,-110℃為0.02nm/s。以上述條件,蝕刻深度約10μm。蝕刻後的組織表面以37°角旋轉噴鍍白金,製取復型膜,再以90°角噴鍍碳加固復型膜。

復型膜處理

從冷凍蝕刻裝置中取出標本,迅速在其表面塗以醋酸戊酯稀釋的2%火棉膠,防止復型膜破裂。室溫下充分乾燥後將標本浮於家庭用漂白劑(次亞氯酸鈉)中約1h,溶解掉復型膜以外的其它組織。然後將復型膜移至蒸餾水中,沖洗數次後載到銅網上。室溫下乾燥後浸入醋酸戊酯或丙酮中除去火棉膠。

鏡檢

自然乾燥後透射電鏡觀察。

結果與討論

用卵白蛋白誘發大鼠免疫複合物性腎小球腎炎模型〔6,7〕,取模型組和對照組大鼠腎臟,按上述方法製取復型膜,透射電鏡觀察。結果如圖1～6所示,用QF-DE技術所觀察到的組織細胞的三維超微結構不僅清晰逼真,而且可以揭示一些普通電鏡技術難以揭示的現象。套用EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置完全可以做出高質量的QF-DE復型膜。因此,在沒有足夠資金購買新型冷凍蝕刻裝置前,套用國內現有的EikofD-2A型冷凍蝕刻裝置探討組織細胞接近生活狀態的三維超微結構是可行的。

普通電鏡標本製作過程存在的缺點可概括如下:①化學固定引起細胞內物質移動及微細構造的改變,特別是不可避免地引起以鈉為主的電解質及金屬離子的移動及流出;②化學固定引起組織結構變形,如細胞內的細胞骨架及許多可溶性蛋白質相互架橋;③脫水引起脂質等細胞內物質丟失;④包埋、聚合過程使本來含有多量水分的細胞陷於過乾狀態;⑤透射電鏡觀察需將本來直徑約10μm的立體的細胞切成0.05～0.1μm的薄片,故電鏡下所看到的不是三維結構而是二維結構;⑥醋酸鈾和鉛鹽染色沉澱增加了人工產物。

QF-DE技術是將含有大量水分的組織細胞輕微固定,或新鮮標本不固定,在液氮中用純銅塊壓迫促其迅速冷凍,或在異戊烷-丙烷混合液中迅速冷凍,使其從組織表面深約10～20μm範圍內形成玻璃化狀態。與以前的冷凍法相比,冷凍速度快,因而稱之為急速冷凍。冷凍後的組織在高真空狀態下,使溫度上升至100℃左右,目的是將固態的水分繞過液態而迅速升華,組織內的冰得以消融,遂使細胞膜以及細胞內外的固有構造得以更清楚地暴露出來。這一使存在於細胞內外的冰在真空狀態下充分升華的過程稱為深度蝕刻。與冷凍蝕刻法相比,QF-DE法有如下特點:①不用或少用化學固定,因而減少人為引起的組織細胞超微結構的變化;②冷凍速度快,能捕捉到瞬間的形態學變化;③由於不使用防凍劑,蝕刻深,不僅能觀察膜的疏水面,而且能觀察親水性的膜表面及細胞內外的三維超微結構。

QF-DE法是電鏡領域新技術之一,可用於觀察組織細胞接近生活狀態的三維超微結構,解析度高,尤其適用於觀察細胞骨架和細胞外基質,具有廣闊的套用前景。近年來,用QF-DE技術所進行的研究,獲得了許多常規電鏡所無法得到的超微結構新知識。迄今的研究多用於動物組織,期待今後用於人體組織,相信會得到許多有價值的資料。