《海冰細菌Colwellia sp.硫氧還蛋白(Trx)的基因克隆與功能分析》是依託哈爾濱工業大學，由王全富擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：海冰細菌Colwellia sp.硫氧還蛋白(Trx)的基因克隆與功能分析
- 依託單位：哈爾濱工業大學
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：王全富
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）是一類小分子多功能蛋白，一般都具有高度保守的活性位點(WC[G/P]PC)，它通過還原靶蛋白中的二硫鍵參與酶活性調節、轉錄因子、各種脅迫應答和調控、信號傳導等，在生物抗逆系統中起著重要的作用。前期研究結果表明，Trx可能在南極微生物適應極端環境中發揮重要作用。為此，本研究擬以南極海冰細菌Colwellia sp.為材料，在獲得Trx全長基因序列的基礎上，首先通過生物信息學方法分析Trx基因結構，推測Trx關鍵的活性位點，並預測其功能，進而採用定點突變、轉基因、RT-PCR和Western 雜交等手段對其生物活性和功能進行系統研究，以期從全新的角度和更深的層次認識海冰細菌Trx的功能、活性位點與功能之間的關係，以及Trx在微生物低溫適應性中的作用，進一步完善南極微生物低溫適應性的分子機制，同時也為抗寒冷和抗冰凍生物遺傳育種提供新的基因。
結題摘要
本研究從海冰細菌中克隆出硫氧還蛋白（Trx）全長基因（PsTrx），利用生物信息學方法對PsTrx基因進行了分析和預測。該基因大小為327 bp，編碼108個胺基酸，推測其關鍵活性位點為Cys33和Cys36，含4個α-螺旋和5個β-摺疊。利用定點突變技術進一步驗證Trx蛋白關鍵活性位點。將PsTrx基因轉入E.coli BL21中，實現了異源表達。重組蛋白經Ni-NTA親和層析純化，通過SDS-PAGE和Western blot對蛋白進行了檢測和驗證。在純化基礎上，對重組蛋白的生化活性進行了系統研究。利用FQ-PCR技術分析Trx基因表達特徵，其中9%鹽度下的Trx表達量是對照組的2.5倍；結合轉基因菌株表征分析，探討了Trx基因在海冰細菌耐鹽機制中所起的作用。同時對與Trx相關的TrxR和GST基因進行了克隆、表達以及活性研究。本研究進一步完善海冰微生物極端環境適應機制，為抗逆生物遺傳育種提供了新基因。在項目資助下正式發表論文8篇，其中SCI收錄論文6篇，培養研究生5名。
