《水稻花粉發育中鈣依賴性蛋白激酶21調控的分子機制》是依託北京師範大學，由王英典擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：水稻花粉發育中鈣依賴性蛋白激酶21調控的分子機制
- 依託單位：北京師範大學
- 項目負責人：王英典
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
水稻花粉發育鈣信號受體-鈣依賴性蛋白激酶（OsCDPKs），成為揭示其發育調控分子網路的核心樞紐蛋白。水稻花粉發育中OsCDPKs及其介導的級聯途徑作用分子機理的探索，對於認識花粉形成和/或敗育新機制以及利用基因工程智慧型化創製新品種，擁有重大理論與實際意義。本項研究立足以往長期關於OsCDPKs調控水稻生殖器官發育細胞分子機理研究的理論基礎，在利用轉基因等技術證實了OsCDPK21缺失對花粉後期發育致死的基礎上，觀察敗育的亞細胞結構變化；套用Pull-down Assay結合酵母雙/三雜交與體外蛋白表達等技術，篩選克隆OsCDPK21的靶蛋白及其編碼基因，鑑定其互作性質與方式及其生理作用,並利用轉基因等技術，探明OsCDPK21及其靶蛋白介導的級聯途徑對水稻花粉發育調控的分子機制。本研究可奠定水稻花粉發育分子機制新理論基礎,並以此為探索性開闢水稻智慧型化育種提供新依據與基因資源。
結題摘要
水稻花粉發育鈣信號受體-鈣依賴性蛋白激酶（OsCDPKs），成為揭示其發育調控分子網路的核心樞紐蛋白。水稻花粉發育中OsCDPKs及其介導的級聯途徑作用分子機理的探索，對於認識花粉形成和/或敗育新機制以及利用基因工程智慧型化創製新品種，擁有重大理論與實際意義。本項研究立足以往長期關於OsCDPKs調控水稻生殖器官發育細胞分子機理研究的理論基礎，在利用轉基因等技術證實了OsCDPK21缺失對花粉後期發育致死的基礎上，觀察敗育的亞細胞結構變化；套用Pull-down Assay結合酵母雙/三雜交與體外蛋白表達等技術，篩選克隆OsCDPK21的靶蛋白及其編碼基因，鑑定其互作性質與方式及其生理作用,並利用轉基因等技術，探明OsCDPK21及其靶蛋白介導的級聯途徑對水稻花粉發育調控的分子機制。本項研究主要獲得了重要的研究結果。OsCDPK21缺失轉化致使花粉敗育的超微結構研究表明，轉基因水稻植株花粉發育成熟期發生了細胞凋亡，導致花粉敗育。從而證明OsCDPK21可能參與了水稻花粉發育所必須的信號通路。通過OsCPK21特異互作蛋白及編碼基因篩選與克隆研究，獲得了水稻花粉成熟發育時期35個與OsCPK21特異互作候選蛋白。針對重要的候選互作蛋白Os14-3-3，開展了特異互作蛋白性質與互作方式及其功能的研究。通過酵母雙雜交、體外GST-Pull down和雙分子螢光互補實驗（BiFC）等方式，驗證了OsCDPK21與Os14-3-3之間相互作用的真實性。此外，通過體外磷酸化實驗證明Os14-3-3可被OsCPK21磷酸化。採用胺基酸定點突變磷酸化活性檢測結合phos-tag技術，探明Os14-3-3第138位的酪氨酸為OsCDPK21對其的磷酸化作用位點。此外，通過雙分子螢光互補實驗（BiFC）並結合雷射共聚焦顯微鏡檢測，證明了Os14-3-3第138位酪氨酸的突變並不影響其與OsCPK21之間的相互作用。實施了Os14-3-3及其突變子的過表達目標性轉化，進而揭示了OsCDPK21介導的級聯途徑對花粉發育調控機制。本項研究結果可為揭示水稻花粉發育分子機制奠定新理論基礎，並以此為探索性開闢水稻智慧型化育種提供新依據與基因資源。
