《水稻基腐病菌毒素zeamine的抗性基因克隆及其功能分析》是依託華南農業大學，由張煉輝擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：水稻基腐病菌毒素zeamine的抗性基因克隆及其功能分析
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張煉輝
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
水稻基腐病原細菌（Dickeya zeae）可產生抑制水稻種子萌發的毒素，我們前期工作表明該毒素是重要的致病因子，毒素合成基因突變體喪失抑制水稻種子萌發的能力。經分析，該毒素含有兩個組分，其中組分zeamine（C49H105O4N6）占EC1產毒量的60%，組分zeamineⅡ（C40H88ON5）占40%，且均具有抗菌活性，但zeamine的作用機理不明，且人工接種試驗表明目前尚無抵禦D. zeae的高抗水稻品種。本項目擬在前期研究基礎上，運用基因組大片段酶切或Tn5轉座子插入突變的方法，經毒素抑菌活性檢測，篩選毒素抗性喪失的突變體，以求從產毒菌EC1及其它細菌中克隆zeamine毒素的抗性基因，並利用基因敲除、功能互補等手段進行功能驗證，研究結果將有助於揭示zeamine的作用機理，闡明D. zeae抵抗zeamine的機制，提供新的抗性基因用於生防菌構建及轉基因防治病害。
結題摘要
本項目對水稻基腐菌D. zeae EC1的產毒培養基進行最佳化，獲得了高產毒培養基LS5，其zeamines產量比基礎培養基高約30倍，為後期zeamines抗性基因和抗性菌株的篩選奠定了基礎。同時，為便於抗性基因的鑑定及其調控機理解析，我們完成了對EC1的全基因組測序分析並對產毒菌EC1通過Tn5轉座子插入突變獲得了49,010株突變株，通過毒素抑菌活性檢測篩選到兩株抗性減弱8倍的突變菌株，通過hi-TAIL PCR和生物信息學分析，鑑定到EC1中兩個zeamines抗性相關係統，分別為RND類外排泵DesABC介導的zeamines抗性和Zrg基因簇介導的zeamines抗性。前者敲除desA、desB基因和desC基因後，對zeamines的MIC分別降低了8、8和32倍，通過比較菌株對zeamines及同類抗生素在不同條件下的耐受能力，發現DesABC對zeamines的抗性主要源於其對zeamines的直接轉運作用和介導了zeamines及同類抗生素的靶標的保護；後者Tn5插入在一個多基因（BCADTEF）的操縱子中，命名為zrg 基因簇，操縱子當中的ABCDT基因與zeamines的抗性有關。通過提取基因簇中各基因突變體的脂多糖，發現△zrgC、△zrgA和△zrgE核心多糖缺失，△zrgF上O-抗原缺失，核心多糖和脂質A增多，表明zrg基因簇參與了脂多糖合成，而△zrgB、△zrgD和△zrgT的脂多糖結構與野生型EC1相似，但其zeamines產量顯著降低。在抗zeamines菌株篩選方面，從土壤中分離出5,000個菌株，篩選到7株對zeamines抗性增強200倍以上的菌株，選其中抗性最強的兩株菌株進行深入研究。進一步實驗證明，這兩株菌可能產生zeamines降解酶。對菌株LS465通過構建Fosmid文庫（含4,000多個陽性轉化子），篩選到30個對zeamines抗性較高的轉化子，其中有F2、 F3 、F4、 F5 、F6 、F7對zeamines抗性超過大腸桿菌的40倍。現已對其中五個轉化子的全部序列進行分析，為明確LS465抗zeamines毒素的通路和整個抗性機制，構建了Tn5轉座子突變體庫，已從7,000株突變株中篩選出16株抗性減弱的突變體。綜上所述，本項目順利完成課題預定目標，共發表8篇科研論文，其中SCI收錄論文7篇，並申請專利2項
