氣體信號分子硫化氫對椎間盤退變的影響及作用機制

《氣體信號分子硫化氫對椎間盤退變的影響及作用機制》是依託北京大學，由李淳德擔任負責人的專項基金項目。

基本介紹

• 中文名：氣體信號分子硫化氫對椎間盤退變的影響及作用機制
• 項目負責人：李淳德
• 依託單位：北京大學
• 項目類別：專項基金項目

項目摘要

椎間盤退變性疾病是臨床上常見的引發腰背痛的頑疾，其發病機制尚不明確。新型氣體信號分子硫化氫是否存在於椎間盤髓核組織中及其是否在椎間盤退變過程中起作用目前國內外尚無報導。既往課題組在研究中發現體外培養的大鼠髓核細胞表達硫化氫內源性合成酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）及胱硫醚-γ-裂解酶（CSE），並對髓核細胞凋亡其調節作用。因而，我們假設氣體信號分子硫化氫存在於椎間盤組織內，並可能隨椎間盤退變過程而發生變化，對椎間盤退變產生影響。為此，本課題：①研究椎間盤退變（IVDD）患者椎間盤組織中CBS及CSE的表達與椎間盤退變程度的關係；②建立不同時間組IVDD動物模型並原代培養人退變間盤髓核細胞，給予不同濃度外源性硫化氫供體硫氫化鈉及內源性硫化氫合成酶抑制劑炔丙基甘氨酸（PPG）干預，觀察髓核細胞凋亡，細胞外基質等的變化，以闡明H2S對間盤退變進程的影響和作用機制。

結題摘要

本課題主要分為三個部分： 第一部分：將20隻紐西蘭大白兔分為假手術組和實驗組，術後三周全部處死。採用HE染色研究椎間盤組織病理學變化，採用Realtime-PCR法研究IIa型膠原mRNA及Aggrecan mRNA相對表達量，對椎間盤退變模型進行鑑定。證實針刺纖維環損傷椎間盤退變模型是一種可複製的用於椎間盤退變研究的動物模型。 第二部分：將建立椎間盤退變模型的30隻紐西蘭大白兔分為實驗3周組﹑實驗6周組及實驗12周組，分別在術後3周﹑6周﹑12周全部處死。採用HE染色研究椎間盤組織病理學變化，採用Realtime-PCR法研究IIa型膠原mRNA及Aggrecan mRNA相對表達量。採用免疫組化及Western blotting法檢測硫化氫合成酶CBS和CTH在髓核細胞內的表達變化，用敏感硫電極法測定各組硫化氫產率反應內源性硫化氫合成酶活性。採用Western blotting法檢測抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2﹑凋亡執行蛋白Caspase 3作用底物蛋白PARP﹑促凋亡蛋白Bax表達變化。證實針刺纖維環損傷椎間盤退變模型中，隨著椎間盤退變的加劇，細胞凋亡相關蛋白與內源性硫化氫體系表現出同步的變化趨勢。 第三部分：體外培養正常3月齡紐西蘭大白兔髓核細胞傳代至第3代進行下一步實驗，首先給予TNF-α(50ng/ml)和不同濃度外源性硫化氫供體硫氫化鈉處理，培養24小時後採用CCK-8法檢測各組細胞活力，選取對髓核細胞活力影響最大的硫氫化鈉濃度進行下一步的實驗；再將髓核細胞按處理方法不同分為6組：正常對照組﹑外源性硫化氫供體硫氫化鈉（NaHS）處理組﹑內源性硫化氫合成酶抑制劑（PPG）處理組﹑TNF-α處理組﹑TNF-α+PPG處理組﹑TNF-α+NaHS處理組。採用免疫螢光染色檢測CBS及CTH在正常未處理髓核細胞內的表達。採用Western blotting法檢測抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2﹑凋亡執行蛋白Caspase 3作用底物PARP蛋白﹑促凋亡蛋白Bax表達變化，並檢測Caspase 3活性。證實原代培養正常椎間盤髓核細胞實驗提示外源性硫化氫可以部分拮抗TNF-α誘導的髓核細胞凋亡。