毛細管電泳色譜法

毛細管電泳色譜法

毛細管電泳色譜法(capillary electrochromatography; CEC)是毛細管電泳與液相色譜相結合形成的一種高效、快速微分離分析技術。毛細管電泳色譜法可以分離離子和中性分子。它是利用緩衝溶液的電滲流作為泵,使被分析的分子通過對其具有不同保留程度的第二相,達到分離的目的。

基本介紹

  • 中文名:毛細管電泳色譜法
  • 外文名:capillary electrochromatography
  • 性質:物理化學分析方法
基本概念,優缺點,基本理論,電泳,電滲流,分離原理,兩種裝置,儀器基本結構,進樣系統,電源及其迴路,溫度控制,檢測系統,主要分類,填充色譜,膠束色譜,

基本概念

電泳(electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場作用下發生遷移的電動現象。
毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)是利用被分析離子在電場作用下移動的速率不同而達到分離的目的,這種技術主要用來分析在毛細管緩衝溶液中能離解為離子的物質。
毛細管電泳是一類以高壓直流電場為驅動力,毛細管為分離通道,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現分離的新型液相分離分析技術。
毛細管電泳是分析科學中繼高效液相色譜之後的又一重大進展,它使分析科學從微升水平得以進入納升水平,並使單細胞分析成為可能。
毛細管電泳色譜法是毛細管電泳與高效液相色譜(HPLC)的有機結合,其基本理論、儀器裝置與毛細管電泳大致類似。最大的不同是毛細管柱引入了色譜固定相,使CEC同時具有CE與HPLC的分離機理,對中性物質和荷電物質都能達到理想的分離效果。

優缺點

優點:操作簡單,試樣量少,分離效率高,成本低等。
分離能力強,分離速度快,進樣量小。
像高效液相色譜,能夠分離不帶電荷的物質。
像毛細管電泳法,不需要壓力泵系統的情況下,提供了微量體積試樣溶液的高效分離通過電滲流泵,而不是通過機械輸送流動相通過固定相的。
明顯地簡化了輸送體系。
電滲泵產生的是塞子式流動輪廓,而不是流體動力學輪廓,因此毛細管電色譜的分離柱效比高效液相色 譜法高。
缺點:在遷移時間上的重現性,進樣的準確性和檢測靈敏度方面比高效液相色譜法稍遜。

基本理論

電泳

在電解質溶液中,帶電粒子在電場作用下,以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場方向遷移的現象叫作電泳。陰離子向正極方向遷移,陽離子向負極方向遷移,中性化合物不帶電荷,不發生電泳運動。

電滲流

在電泳過程中還存在另一種電動現象,即電滲。當高電壓通過含有緩衝溶液的毛細管柱時,體相溶液整體朝向一個方向運動,產生電滲流。在柱內層氧化矽與溶質的界面上形成雙電層是電滲流產生的原因。
在典型的毛細管電泳分離中,若有電滲存在,離子的洗脫順序是: 首先是最快的陽離子,緊接著是依次減慢的陽離子,然後是全部的中性分子在一個區域出現,最後是最慢的陰離子,緊接著的是依次加快的陰離子。
電滲是CE的基本現象之一,它可以控制組分的遷移速率和方向,進而影響CE的分離效率和重現性,所以電滲流控制是CE中的關鍵問題或技術之一。
影響電滲流的因素很多,直接影響因素有:
1. 電場強度
2. 溫度
3. pH值
4. 緩衝液溶劑
5. 離子強度
6. 添加劑
7.管壁塗層

分離原理

電泳和電滲流並存,在不考慮相互作用的前提下,粒子在毛細管內電介質中的遷移速率是兩種速率的矢量和,在典型的毛細管電泳分離中,溶質的分離基於溶質間電泳速率的差異。電滲流的速率絕對值一般大於粒子的電泳速率,並有效地成為毛細管電泳的驅動力。溶質從毛細管的正極端進樣,帶正電的粒子最先流出,中性粒子次之,帶負電的粒子在中性粒子之後流出。溶質依次通過檢測器,得到與色譜圖極為相似的電泳分離圖譜。
毛細管電色譜由於引入了色譜機制,其保留機理包括兩個方面:
其一,如同HPLC,基於溶質在固定相和流動間分配過程;
其二,如同CE,基於溶質電遷移過程。
由於CEC既能分離電中性溶質,又能分離帶電溶質,對複雜的混合樣品顯示出強大的分離潛力。

兩種裝置

毛細管電泳和電色譜儀器裝置

  

儀器基本結構

儀器裝置儀器裝置
一般在一根長 40 ~ 100 cm, 內徑 10 ~ 100 mm 的毛細管柱中充入緩衝溶液,柱的兩端置於兩個緩衝池中。在兩個緩衝池之間的毛細管接有兩個鉑電極。試樣從一端進入,而檢測器則在另一端。使用的高電壓可以反相,以能分析陰離子。

進樣系統

毛細管分離通道十分細小,整個柱體積一般只有4~5μL,所需的樣品區帶只有幾納升。
毛細管電泳的進樣方式一般是將毛細管的一端從緩衝液移出,放入試樣瓶中,使毛細管直接與樣品接觸,然後由重力、電場力或其他動力來驅動樣品流入管中。進樣量可以通過控制驅動力的大小或時間長短來控制。CE進樣技術均適用於CEC。
一般的進樣方式是電動進樣和壓力進樣。
電動進樣是將毛細管柱的一端及其相應端的電極從緩衝池中移出,放入試樣杯中,然後在一準確時間範圍內施加壓力,使試樣因離子移動和電滲流進入毛細管柱。
壓力進樣是用壓差使試樣溶液進入毛細管。產生壓差的辦法可以採用在檢測器端抽真空,或者通過提高試樣端液面。

電源及其迴路

電流迴路系統包括高壓電源、電極、電極槽、導線和電解質緩衝溶液等。CE和CEC一般採用0 ~ ±30 kV連續可調的直流高壓電源。理想的電源應具備:
1.能輸出單極直流高壓(一端接地);
2.電壓、電流、功率輸出模式任意可選;
3.能控制電壓、電流或電功率的梯度;
4.電壓輸出精度應高於1%。
CE的電極通常由直徑0.5~1 mm的鉑絲製成。
電極槽,即緩衝液瓶,通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑膠瓶(1~5 mL不等),要便於密封。緩衝液內含電解質,充於電極槽和毛細管中,通過電極、導線與電源連通,一同構成整個電流迴路。

溫度控制

熔融石英毛細管在CE中套用最廣泛,熔融石英拉製得到的毛細管很脆,易折斷,一般在外表面塗有聚醯亞胺保護層,使之變得富有彈性,不易折斷。
內徑越小,表面積/體積比越大,散熱效果越好。內徑小,樣品負載小,檢測、進樣、清洗等操作困難。
一般使用的毛細管柱內徑在25 ~100 μm之間,最常用的是50 μm和75 μm兩種。
檢測視窗部位的外塗層剝離。
焦耳熱效應產生徑向溫度梯度,還會導致分離重現性差。商品儀器大多有溫度控制系統,主要採用風冷和液冷兩種方式。
一般採用物理吸附或化學鍵合兩種方式形成毛細管內壁塗層,對石英毛細管進行改性或修飾,可有效控制電滲流、抑制吸附進而最佳化分離。

檢測系統

常用檢測器
紫外:適合於有紫外吸收化合物
螢光:靈敏度高,通常需要衍生化
雷射誘導螢光:靈敏度非常高,通常需要衍生化
質譜:通用性好,能提供結構信息
安培:靈敏度高,只適合於電活性物質
電導:通用性好

主要分類

將CE的高效柱和HPLC的高選擇性有機結合起來,開闢了高效的微分離技術新途徑,它的分離過程包含了電泳和色譜兩種機制,溶質根據他們在流動相和固定相的分配係數不同和自身的電泳淌度差異而分離。

填充色譜

基於填充柱的電色譜是各種電泳中最新出現的一種技術。它是利用電滲透驅動極性溶劑通過反相高效液相色譜毛細管柱,利用試樣在兩相的分配進行分離。

膠束色譜

是在緩衝溶液中加入濃度高於膠束臨界濃度的表面活性劑。膠束相在分離中起到了準固定相的作用,電中性的有機化合物按照它們在水相和有機相之間分配係數的差異進行分離。該方法也可用來改善帶電有機化合物的分離選擇性。

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