條件性基因打靶

條件性基因打靶(conditional gene targeting)，可定義為將某個基因的修飾限制於小鼠某些特定類型的細胞或發育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系統與基因打靶技術相結合的基因打靶技術。它實際上是在常規的基因打靶的基礎上，利用Cre重組酶介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空範圍上設定一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的範圍和時間處於一種可控狀態。

研究背景

基因打靶技術儘管克服了經受精卵原核顯微注射技術引起的，諸如外源基因隨機整合，其拷貝數不能控制的局限性，但由於Knockout小鼠的所有細胞基因組上都存在基因的缺失/突變，往往引起嚴重的發育缺陷或胎兒死亡，不利於在發育後期階段基因功能的分析。即使發育完整的突變體小鼠，對於Knockout表型的解釋常遇到兩個困難問題：一是所有體細胞基因的剔除，很難將異常的表型歸於哪一類細胞或組織，二是很難排除在成熟動物上由於發育缺陷所引起的異常表型。另外，由於廣泛套用neo和HSVtK作為正負選擇系統，發生同源重組的細胞基因組中總留有外源的選擇標記（如neo）基因；該基因可能影響相鄰基因的表達，不利於對突變表型的精確分析。以Cre-LoxP系統與基因打靶技術相結合的條件性基因打靶克服了上述的局限性。

原理及策略

Cre-LoxP和來自酵母的FLP-frt系統可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型。通過常規基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的LoxP，並以此兩側裝接上LoxP的LoxP標記ES細胞產生LoxP標記小鼠。然後，通過將LoxP標記小鼠與Cre轉基因鼠雜交（也可以其他方式向小鼠中引入Cre重組酶），產生靶基因發生特定方式（如特定的組織特異性）修飾的條件性突變小鼠。在LoxP標記小鼠，雖然靶基因的兩側已各裝上了一個LoxP，但靶基因並沒有發生其他的變化，故LoxP標記小鼠表型仍同野生型的一樣。但當它與Cre轉基因小鼠雜交時，產生的子代中將同時帶有LoxP標記靶基因和Cre基因。Cre基因表達產生的Cre重組酶就會介導靶基因兩側的LoxP間發生切除反應，結果將一個LoxP和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾是以Cre的表達為前提的。Cre的表達特性決定了靶基因的修飾持性：即Cre在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾就發生在哪種組織細胞；而Cre的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。所以只要控制Cre的表達特異性和表達水平就可實現對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

因此，其原理主要是運用打靶基因置於同向LoxP之內的打靶載體，經在ES細胞上同源重組及篩選，將攜帶該載體的小鼠與受控於組織特異性啟動子或誘導性啟動子的Cre基因的TgM交配，經Cre介導重組，即可獲得靶基因在某一組織器官或發育時期上修飾的小鼠。

Gu首先套用該策略在TgM體內成功地實現了DNA聚合酶β基因在T細胞上基因打靶。Cre介導的在腦、乳腺、腸等組織器官的條件性基因打靶小鼠亦相繼產生。

條件基因打靶特點

①通過條件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效應的基因的功能以及基因在特定的組織細胞或個體發育特定階段的功能。

②通過條件性基因激活，實現轉基因的可控制性表達。

③通過Cre切除條件性基因修復(Cre excision-conditional gene repair)，進行基因的可修復性敲除，以研究一個基因的多種功能。