《桿狀病毒pk-1基因調控病毒極晚期轉錄的分子機制研究》是依託揚州大學，由梁昌鏞擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：桿狀病毒pk-1基因調控病毒極晚期轉錄的分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：梁昌鏞
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
桿狀病毒AcMNPV的極晚期基因如多角體基因具有超強表達的能力，這使得其成為最廣泛使用的真核表達載體之一。然而病毒極晚期基因超量表達的機制目前還並未闡明。已有研究表明桿狀病毒的pk-1基因參與病毒極晚期轉錄調控，但具體機制並不清楚。本課題擬利用原核表達不同點突變或截短型pk-1基因，並進行激酶活性分析，以揭示PK-1蛋白的結構與激酶活性的關係。通過EMSA分析多角體啟動子與PK-1親和的序列特異性。通過缺失互補實驗，分析突變pk-1對缺失pk-1 病毒的極晚期基因表達的拯救與否，確定PK-1蛋白調節桿狀病毒極晚期轉錄的功能域。另外，通過分子相互作用實驗，確定與PK-1相互作用的晚期轉錄相關因子，利用體外激酶催化實驗，分析PK-1激酶活性對晚期轉錄因子的作用和特異性。最後，分析PK-1蛋白對晚期轉錄因子的磷酸化與調控極晚期基因轉錄的關係。從而揭示桿狀病毒pk-1基因調控極晚期轉錄的分子機理。
結題摘要
病毒編碼的蛋白激酶只存在於大型的DNA病毒中，在皰疹病毒中，其主要與病毒的毒力有關。在桿狀病毒中，AcMNPV也編碼了一個蛋白激酶——PK-1。PK-1是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，目前它的功能還並不清楚。本項目對PK-1的激酶活性催化域及其在病毒複製、增殖過程中的功能進行了研究。為了研究PK-1在病毒生命循環過程中的作用，分別構建了pk-1缺失、拯救的重組AcMNPV Bacmid。缺失pk-1基因的AcMNPV Bacmid 沒有感染症狀產生，而pk-1拯救的AcMNPV Bacmid可以互補pk-1的缺失，產生感染性病毒粒子。因此，pk-1為病毒複製必需基因。實時螢光定量PCR（qPCR）結果顯示，pk-1基因的缺失不影響病毒DNA的複製。通過構建一系列pk-1截短型拯救的AcMNPV Bacmid並分析了它們拯救能力，結果表明PK-1的蛋白激酶催化域（PKc）對於感染性病毒的產生是至關重要的。原核表達這些截短體並體外分析它們的激酶活性，結果表明那些能夠拯救缺失pk-1 AcMNPV 的截短片段都具有激酶的活性，而不能拯救缺失pk-1 AcMNPV 的截短片段都沒有檢測到激酶活性。因此，PK-1的激酶活性對於病毒的複製至關重要。電鏡切片觀察顯示，pk-1基因的缺失的重組病毒不能產生正常的核衣殼，而產生了大量未包裝病毒基因組的長的空管狀結構。推測PK-1通過磷酸化與DNA包裝相關的蛋白來影響病毒核衣殼的組裝。
