《核酸適配體TY04靶向Annexin A2抗多發性骨髓瘤的機制研究》是依託中南大學，由劉靜擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：核酸適配體TY04靶向Annexin A2抗多發性骨髓瘤的機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：劉靜
- 依託單位：中南大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
多發性骨髓瘤(MM)發病率隨著人口老齡化升高，嚴重影響健康。基於Cell-SELEX技術篩選到的核酸適配體TY04，為單鏈DNA分子，長84個鹼基，能呈序列特異性與MM細胞穩定結合，抑制MM增殖，阻滯周期於G2/M期，蛋白酶消化實驗表明TY04能與膜表面蛋白結合,利用IP技術結合液質聯用質譜以及免疫螢光實驗，結果提示可定位於細胞表面評分排第一位的膜聯蛋白A2(ANXA2)是TY04潛在靶標。本項目提出TY04靶向結合ANXA2，引起ANXA2功能失活，抑制JNK通路活化，影響c-jun活性，導致細胞周期分子紊亂而阻滯於G2/M期，發揮抗MM作用的新構想。本項目將鑑定TY04與ANXA2的結合；明確TY04通過作用ANXA2抑制JNK信號通路激活；在體內外明確TY04通過作用ANXA2發揮抗MM作用。本研究有助於MM治療新靶標的發現,促進具有自主智慧財產權的MM核酸類新藥研發，具有源頭創新性。
結題摘要
多發性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是漿細胞來源的血液系統的惡性腫瘤。雖然其治療已取得很大進展，但由於其易復發，仍是一種不可治癒的血液腫瘤，因此需要開發診斷和治療MM的新方法。膜聯蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是Annexins超家族中A亞家族的重要成員，MM患者高表達ANXA2，且高水平ANXA2與患者總存活率和無病生存率負相關，提示ANXA2是MM潛在的診斷和治療靶標。核酸適體通過摺疊形成特定的三維結構與靶標分子結合，具有高親和力、高特異性、低免疫原性和生物毒性、組織滲透力強、易於合成和標記等特點，核酸適體在臨床診斷與治療方面展示出較大套用潛力。 本課題擬針對ANXA2蛋白篩選特異性核酸適體，首先我們構建了pET-42a-ANXA2的原核表達載體，通過IPTG誘導表達，純化後獲得GST-ANXA2重組融合蛋白。然後利用protein-SELEX技術，使用GST-ANXA2重組融合蛋白作為篩選靶標，GST蛋白作為負性篩選；以包含有80個鹼基的隨機單鏈DNA寡核酸庫作為初始庫，通過逐步減少正篩孵育時間，增加洗滌次數和負篩孵育時間等增加篩選壓力，經過九輪篩選後將第九輪篩選產物通過高通量測序。通過測序和酶聯寡核苷酸分析，wh6核酸適體對ANXA2蛋白的親和力最高，因此wh6被作為本課題後續研究對象。 通過提取MM細胞的膜蛋白並與生物素標記的wh6核酸適體孵育，Aptamer-pulldown結果也證明wh6能與細胞中ANXA2蛋白結合。通過酶聯寡核苷酸分析wh6與ANXA2蛋白的結合常數為8.75±1.26 nM。通過shRNA慢病毒敲低MM細胞中的ANXA2蛋白，wh6與MM細胞結合能力減弱。建立SCID免疫缺陷小鼠異體移植MM細胞成瘤模型，結果顯示wh6在體內與ANXA2蛋白高表達的MM細胞具有強靶向結合能力。多發性骨髓瘤患者樣本結合實驗顯示，與DNA-lib相比，wh6能與多發性骨髓瘤患者骨髓細胞中CD138陽性細胞顯著結合。同時，wh6可以抑制由ANXA2誘導的RPMI-8226和MM.1S細胞的生長，並能阻斷MM細胞對ANXA2粘附。 綜上，本課題篩選到靶向ANXA2蛋白的核酸適體wh6可作為多發性骨髓瘤診斷和治療的候選工具。
