《核外ATM蛋白在脂蛋白內吞過程中的作用及機制》是依託武漢大學，由吳東方擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：核外ATM蛋白在脂蛋白內吞過程中的作用及機制
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：吳東方
- 依託單位：武漢大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
核外ATM蛋白在細胞囊泡運輸及蛋白質轉運過程中起重要作用。前期工作證實ATM雜合子(ATM+/-)突變可降低乳糜微粒殘粒(CRs)清除而顯著增高apoE缺失鼠血漿膽固醇水平,改變肝細胞CRs內吞過程中形成的胞漿內涵體蛋白質組的表達，降低其ATM蛋白含量，減少CRs攝取，促進As形成。本研究擬採用共聚焦雷射掃描顯微鏡、免疫沉澱結合質譜分析等方法分析ATM蛋白在肝細胞核外亞細胞組分中的分布及含量，明確核外ATM蛋白介導CRs內吞過程中可能作用的亞細胞部位，獲得細胞核外與細胞內吞過程中相關的ATM結合蛋白及相互作用的蛋白質種類及性質,觀察核外ATM蛋白對CRs內吞過程的影響，以期闡明核外ATM蛋白在CRs內吞過程以及As形成中的作用及機制。闡明這些問題對深入認識核外ATM蛋白的作用和功能以及指導ATM+/-攜帶者As的防治工作具有十分重要的理論價值和臨床意義。
結題摘要
ATM蛋白主要以無活性的多聚體存在於細胞核中，但核內ATM蛋白的功能尚難以完全解釋ATM蛋白缺失所表現的與動脈粥樣硬化相關的一些病理特徵如高膽固醇及甘油三酯血症等。目前認為核外ATM蛋白在細胞囊泡運輸及蛋白質轉運過程中起重要作用，但其在肝細胞脂蛋白殘粒轉運及代謝中的作用及機制尚未闡明。本實驗採用密度梯度超速離心分離溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、內涵體等亞細胞器及胞漿膜，利用雙向差異螢光電泳、蛋白免疫印跡及免疫共沉澱等方法分析ATM蛋白在肝亞細胞組分中的分布，明確核外與ATM結合及相互作用的蛋白，並探討其在肝細胞脂質代謝中的作用，以闡明核外ATM蛋白在脂蛋白內吞過程中的作用及機制。實驗結果顯示，ATM基因缺失，apoE-/-小鼠肝細胞對脂蛋白殘粒結合沒有明顯影響，但可顯著降低肝細胞對脂蛋白殘粒的攝取，明確了ATM缺失時apoE-/-小鼠血漿脂蛋白增高的原因。雙向差異螢光電泳分析提示apoE-/-/ATM+/-小鼠早期及晚期內涵體蛋白與apoE-/-/ATM+/+小鼠比較有19種蛋白存在一定差異，其中13個蛋白在apoE-/-/ATM+/-小鼠表達減少甚至不表達，蛋白免疫印跡分析證實肝臟早期及晚期內涵體中均含有ATM蛋白，提示胞漿中ATM蛋白可能參與脂蛋白的內吞及代謝過程。免疫共沉澱顯示胞漿中PI3K蛋白是ATM的結合蛋白，同時溶酶體、過氧化物酶體、線粒體中均存在有ATM蛋白和PI3K蛋白表達，激活胞漿中ATM蛋白，胞漿中PI3K蛋白活性明顯增加，表明PI3K蛋白可能是ATM蛋白在脂蛋白內吞及代謝過程中的相互作用蛋白。而用ATM蛋白激活劑氯喹激活胞漿中ATM蛋白能增加肝細胞對脂蛋白殘粒的攝取，抑制PI3K蛋白活性，則能明顯減弱其對脂蛋白殘粒的攝取，進一步證實ATM蛋白通過PI3K而介導脂蛋白殘粒內吞及其代謝作用。通過以上實驗研究明確了肝細胞核外ATM蛋白亞細胞分布，證實了PI3K是核外ATM 結合及相互作用的蛋白，並初步闡明ATM蛋白通過PI3K而參與肝細胞脂蛋白殘粒內吞及其代謝的作用機制，為明確動脈粥樣硬化的發病機制及防治ATM＋/-攜帶者動脈粥樣硬化的發生奠定了基礎。
