柑桔黃龍病伴生細菌對亞洲韌皮桿菌體外培養的影響

《柑桔黃龍病伴生細菌對亞洲韌皮桿菌體外培養的影響》是依託重慶大學，由王中康擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：柑桔黃龍病伴生細菌對亞洲韌皮桿菌體外培養的影響
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王中康
• 依託單位：重慶大學

中文摘要

柑桔黃龍病（HLB）是影響全世界柑桔產業安全的毀滅性病害，由韌皮部內生的難培養G-細菌（Cadidatus Liberibacter asiaticus）引起，目前尚無公認的人工培養成功的報導，嚴重阻礙柑桔黃龍病的基礎研究和病害防治的深入開展。研究表明柑桔黃龍病菌與一些其它微生物有伴生現象，本研究擬通過分析柑桔內生菌區系，篩選柑桔黃龍病菌伴生的微生物種類，進而探索柑桔黃龍病菌培養新途徑，並利用實時螢光PCR動態檢測靶標微生物的增殖。研究將構建柑桔內生菌16SrRNA基因文庫，明確可培養原核生物的優勢菌群，探索柑桔黃龍病菌與伴生菌的生態互作關係，建立黃龍病菌半組合協同共培養體系，實現病菌的體外培養並完成柯赫氏證病，為病原菌生物學研究、致病機理探索及防控策略制定提供理論基礎和實驗材料。

結題摘要

【研究背景】柑桔是世界第一大水果，柑桔黃龍病（Huanglongbing，HLB）是柑桔產業的一種毀滅性病害，全世界候選韌皮部桿菌屬（4種），我國主要由亞洲韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. Las)引起。因最近美國農部韌皮部桿菌人工培養的研究報導（Scheler，2008）未能被國內外同行重複驗證，至今沒有獲得公認的純培養，成為嚴重限制柑桔黃龍病病原學和致病機理研究的共性技術難題。解決問題的關鍵在於擺脫純培養的誤區，找出傳代培養難的成因，探索內生細菌薦的互作關係。【研究目標】本基金項目旨在以病/健黃龍病寄主組織和傳病木虱為培養材料，通過分析植物源或蟲媒寄主體內伴生微生物的多樣性及優勢菌群，尋找Ca. Las相關的功能性內生細菌，建立共培養體系並開展相互作用研究。 【研究成果】（1）利用兼性厭氧培養、基於16S rDNA的PCR－RFLP、PCR－DGGE結合的方法，對黃龍病芸香科與非芸香科寄主（柑桔、九里香、黃皮和長春花）病、健組織以及柑桔木虱的內生細菌多樣性進行了系統分析和菌種鑑定，從韌皮部中分離純化124個伴生性內生細菌。發現病、健組織內生細菌的種類和豐度差異明顯，罹病寄主內生菌群結構改變，對病原菌的生長產生不同影響。（2）明確其中可培養優勢菌群：柑桔為微桿菌屬，短小桿菌屬、沙雷氏菌屬和芽孢桿菌屬；長春花有葡萄球菌屬；短小桿菌屬、鞘胺醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬；九里香為芽孢桿菌屬和腸桿菌屬；黃皮中為假單胞菌屬、泛菌屬和不動桿菌；亞洲柑桔木虱（ACP）體內獲得10屬、14種可培養細菌33株，葡萄球菌屬、沙門氏桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬為優勢菌群。柑桔木虱基因測序的未培養優勢菌群包括3種內共生菌、合胞體共生菌以及亞洲韌皮部桿菌；而柑桔、九里香中均為沙雷氏菌屬。（3）利用微生態學特性鑑定出對HLB病原菌生長有抑制性、促生性的功能性菌株11株，其中低菌量九里香富含澱粉水解能力的抑制性功能菌株具有病害防控潛力。基於最佳化培養體系和條件以及靶標細菌EMA－qPCR活體動態檢測方法，建立符合原生態的病原菌+伴生菌的共培養體系，初步實現黃龍病菌的共培養和成倍增長並完成柯赫氏驗證。【科學意義】項目完成為黃龍病菌共培養及互作分析提供科學的測試平台和高效檢測方法。將推動黃龍病病原菌的基礎研究並為病害防治開闢新途徑。