《枯草桿菌RecQ解旋酶結構與功能的研究》是依託華東師範大學，由任華擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：枯草桿菌RecQ解旋酶結構與功能的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：任華
- 依託單位：華東師範大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
RecQ解旋酶是機體分子代謝途徑中重要的調控蛋白。人體中某些RecQ酶缺失會引起疾病發生。本課題以枯草桿菌RecQ解旋酶為研究對象，研究其蛋白結構與酶生化活性的相互關係，以揭示RecQ解旋酶的分子運作機制。本實驗室前期工作發現枯草桿菌具有兩種異構體，在胺基酸序列上與其他RecQ酶家族成員具有較高的同源性，但卻表現出不同的生化活性。缺失C端蛋白結構域的枯草桿菌RecQ，只能解開簡單的DNA雙鏈結構。具有完整結構的枯草桿菌RecQ能破壞DNA複製中典型的錯誤結構，同時在DNA修復中具有重要作用。其次蛋白結構分析表明，兩者異構體都具有鋅指結構，負責酶與DNA結合作用。隨後本課題將採用放射性技術、螢光檢測技術等解析HRDC結構域、精氨酸指結構在RecQ解旋酶生化活性中的作用,力求發現解旋酶結構與其功能的內在關聯。同時構建RecQ敲除枯草桿菌菌株，探究RecQ調控細胞生長和DNA修復的分子機制。
結題摘要
通過pET原核表達系統，體外表達枯草桿菌RecQ解旋酶兩種異構體：B.subtilis RecQL, B.subtilis RecQS，及其鋅指結構、精氨酸指結構與HRDC結構相關突變體蛋白。通過His親和層析及分子篩，純化各種目的蛋白。螢光偏振技術、ATPase檢測技術、EMSA方法和基於FRET原理的螢光光譜法等方法用於檢測野生型與突變體蛋白的各種酶活性。實驗結果證實：（1）B.subtilis RecQL, B.subtilis RecQS具有典型的RecQ酶活性，表現出DNA依賴性的ATP水解活性，濃度依賴的DNA結合、解旋活性。具有非ATP依賴性、時間和濃度依賴性的DNA退火活性。（2）B.subtilis RecQS 天然缺失C端的HRDC結構域，其各種酶活性表現均低於B.subtilis RecQSL。實驗結果證實HRDC結構域負責B.subtilis RecQ酶對DNA的結合作用，從而促進酶對ATP的水解活性和對DNA的解旋作用，但其不影響酶對DNA的退火活性。（3）胺基酸序列比對與蛋白空間結構分析結果顯示B.subtilis RecQL與B.subtilis RecQS都具有鋅指結構域。各種酶活檢測結果揭示，此功能區域在B.subtilisRecQ酶中不僅負責對DNA的結合作用，而且還有助於促進酶對ATP的水解、DNA的解旋和退火活性。實驗發現鋅指結構對B.subtilis RecQ的正確空間摺疊也具有十分重要的作用。（4）B.subtilis RecQL的R320與R323，B.subtilis RecQS的R319與R322均參與酶對ATP的水解活性，其中B.subtilis RecQL R323與B.subtilis RecQS R322為B.subtili RecQ酶的精氨酸指結構，負責酶對ATP的結合作用，從而輔助酶對ATP的水解活性，幫助進一步對DNA的解鏈作用。但這些精氨酸殘基均不參與RecQ酶對DNA結合作用和退火活性。以上結果表明，鋅指結構、精氨酸指與HRDC結構負責RecQ酶不同的酶活性，與它們在其他RecQ家族成員之間的分子作用機制有一定的差異，它們協同完成酶對底物ATP、DNA的分子作用機制。
