基本介紹
- 中文名：有限細胞系
- 外文名：finite celline
- 特點：細胞系的生存期限有限
- 極限時：細胞將不再分裂並衰老，死亡
- 例子1：毛冠鹿胚胎有限細胞系的建立
- 例子2：幹細胞有限細胞系的建立
有限細胞系,毛冠鹿胚胎有限細胞系的建立,原代培養,傳代培養細胞,細胞遺傳學分析,幹細胞有限細胞系的建立,
有限細胞系
初代培養物開始第一次傳代培養後的細胞，即稱為細胞系，如細胞系的生存期限有限，則稱之為有限細胞系(finite celline)細胞分裂存在一個極限，達到該極限值後，細胞將不再分裂並衰老，死亡，不能進行無限增值。
毛冠鹿胚胎有限細胞系的建立
鹿科動物具有較高的經濟價值，毛冠鹿屬是鹿科麂亞科的2個屬之一，僅有毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)一種動物，為我國特有的二類保護動物。近年來，由於生態環境惡化，食物鏈遭到破壞，該動物日趨減少。1983年張錫然等首次報導了毛冠鹿2種核型，王宗仁又發現了第3種核型。3種核型差異較大，這種差異並不影響個體的表型及生存。因此，毛冠鹿不同個體的細胞遺傳學的染色體進化研究是麂亞科動物的重要研究領域。建立該種動物的細胞系，對研究其染色體多態機制和進化以及物種遺傳、資源保護，都具有重要意義。筆者採用組織塊培養方法以建立毛冠鹿胚胎肺和腎有限細胞系，並對細胞形態、生長速度和染色體形態等生物學特性進行了研究。
原代培養
毛冠鹿細胞原代培養參見施立明等的方法，在無菌條件下取出毛冠鹿胚胎的肺和腎組織，用含雙抗(青黴素、鏈黴素各0.1U/mL)的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌3次，去血污，再用GIBCO199培養液洗1次。在無菌培養皿中剪成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，置培養瓶中貼壁，翻轉180°，CO2培養箱內靜置37℃培養。24h後翻轉培養瓶，補充數滴培養液，96h後加5mL培養液繼續培養。每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態。
傳代培養細胞
長成緻密單層後，棄去培養液，加入0.25%胰酶2～3mL，37℃消化約1min，棄去胰酶，加入培養液，用吸管反覆吹吸至細胞脫落，以1∶2(按原代培養的細胞數)傳代。將胚肺細胞按5.1萬個/mL，胚腎細胞按2.1萬個/mL的濃度分別接種在同一規格的20隻培養瓶中，每天取3隻培養瓶，胰酶處理，使細胞脫落，進行計數，取平均值，繪製生長曲線。
細胞遺傳學分析
染色體分析參照張錫然等方法進行。選取圖像清晰的10張中期照片，測量並統計相對長度、臂比和著絲粒指數，表示並繪製核型模式圖。
毛冠鹿胚肺和胚腎有限細胞系的建立：組織塊貼壁5d後，細胞逐漸從組織邊緣生出，7d後形成生長暈，10d後長成緻密單層。開始傳代培養，並獲成功，有限細胞系建立。毛冠鹿胚肺和胚腎原代細胞形態呈放射狀向組織塊周圍擴散，形成緻密單層。細胞輪廓清晰，立體感強。胚肺傳代細胞呈均一的纖維狀，3～4d可形成緻密單層。胚腎細胞多數情況下形成不規則的分枝狀，細胞所占空間較大。
幹細胞有限細胞系的建立
目的:建立腦源性神經營養因子基因修飾的人骨髓間充質幹細胞系。
方法:常規分離培養人骨髓間充質幹細胞，流式細胞術檢測骨髓間充質幹細胞表面分子CD34、CD44、CD45，採用重組逆轉錄病毒載體將腦源性神經營養因子基因轉入人骨髓間充質幹細胞。檢測腦源性神經營養因子基因修飾的骨髓間充質幹細胞的增殖特性，細胞內腦源性神經營養因子的蛋白表達，細胞培養液中腦源性神經營養因子含量，以及PCR檢測腦源性神經營養因子-骨髓間充質幹細胞中外源性腦源性神經營養因子基因DNA。
結果:①人工分離培養出的骨髓間充質幹細胞，形態、大小一致，呈長梭型或長多邊形，從P0至P20基本保持一致，P2代骨髓間充質幹細胞表達基質細胞表面標誌CD44，不表達造血系細胞表面標誌CD34、CD45。②反轉錄病毒感染骨髓間充質幹細胞的感染效率約為10%，修飾後形成的腦源性神經營養因子-骨髓間充質幹細胞在形態上始終保持一致，與骨髓間充質幹細胞幾乎完全一樣，生長速率與未經基因修飾的骨髓間充質幹細胞基本相同，培養10代後細胞停止分裂，免疫細胞化學染色顯示腦源性神經營養因子-骨髓間充質幹細胞的腦源性神經營養因子陽性率超過98%，培養72h後培養基中腦源性神經營養因子的含量較之骨髓間充質幹細胞提高約20000倍。③PCR對腦源性神經營養因子-骨髓間充質幹細胞基因組DNA進行擴增，得到外源性腦源性神經營養因子條帶。結論:利用反轉錄病毒載體進行基因修飾得到了穩定的腦源性神經營養因子基因修飾的人骨髓間充質幹細胞有限細胞系，為基因治療提供了一種以多潛能成體幹細胞為載體的種子細胞。
