《最佳化酵母萜類代謝途徑增強紫杉醇前體表達研究》是依託重慶大學，由黃曉斌擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：最佳化酵母萜類代謝途徑增強紫杉醇前體表達研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：黃曉斌
- 依託單位：重慶大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
紫杉醇( taxol,商品名 Paclitaxe1 )作為一種有效的天然抗癌藥物，自1992年被美國FDA批准用於臨床以來，得到了大量的研究。目前用於醫藥的紫杉醇主要從紅豆杉的樹皮中提取，或者從其中間產物巴卡亭Ⅲ半合成而來，但其含量都十分低，這就限制了紫杉醇的進一步套用。本研究擬以釀酒酵母中的二萜類生物合成途徑為研究對象，分三個階段對酵母進行遺傳改造，通過調節酵母中關鍵限速酶表達水平、轉入紫杉醇生物合成的關鍵酶基因的方法來改變酵母的萜類整體代謝通路，使其適合紫杉醇及其前體物質的合成。這為進一步研究紫杉醇的代謝通路打下堅實基礎。
結題摘要
紫杉醇因其特別的抗癌效果，在癌症治療上有著越來越廣泛的套用。為了尋找另外一種方法生產紫杉醇，本課題用基因工程的方法，改造微生物遺傳通路，通過發酵來生產紫杉醇前體。在具體研究中，主要選擇釀酒酵母、大腸桿菌來作為宿主菌。在釀酒酵母中，以其二萜類生物合成途徑為主要研究對象，通過抑制旁路代謝的關鍵基因ERG9和COQ1的轉錄及表達，以此減弱甲羥戊酸（MVA）途徑向甾醇和輔酶Q方向的代謝流，同時通過改造MVA上游途徑的六個酶基因ERG13、HMGR2、ERG12、ERG8、MVD1、IDI1的表達強度來增加其二萜類合成前體IPP（異戊烯焦磷酸）和DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）的庫量水平。然後轉入紫杉醇生物合成的下游途徑中的2個基因：GGPPS、TXS，使其在酵母中異源表達。在大腸桿菌中，以其本生的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP途徑)為改造對象，構建MEP1（包含dxs、ispD、idi、ispF四個基因）、MEP2（包含ispC、ispE、ispH、ispG四個基因）、TG（包含GGPPS、TXS兩個基因）三個模組，通過不斷調節啟動子強弱及拷貝數的多少來篩選最佳組合。同時建立GC-MS的方法來檢測改造後的菌株表達紫杉醇前體紫杉二烯的情況。通過大量的實驗研究，我們得到三方面的研究結果：1.在釀酒酵母中，成功構建兩個上下游基因模組（MVA′、TG），獲得生產紫杉二烯的菌株，但產量極低；2.在大腸桿菌中，成功構建上、下游三個基因模組（MEP1、MEP2、TG），並能穩定篩選；3.通過不斷基因表達強度組合實驗，在大腸桿菌中篩選到一紫杉二烯的高產菌株（190mg/L）。通過此課題研究，證明了釀酒酵母、大腸桿菌等微生物可以通過基因工程改造手段來生產紫杉醇前體物質4(5)，11(12)紫杉二烯以及其他中間體。有理由相信，在不久的將來，利用微生物發酵技術來生產紫杉醇、人參皂苷等植物天然藥物必將有更大的突破。
